本发明专利技术公开了一种靶向人肝细胞的RNA适配子及其核苷酸序列，涉及肝脏疾病的诊断与治疗领域，该RNA适配子为肝脏疾病诊疗领域提供了一种特异高效的靶向肝细胞的新型分子。本发明专利技术应用新的组合化学技术SELEX，以肝脏ASGPR大亚基为靶蛋白，从单链RNA随机文库中筛选出了能与ASGPR特异性RNA适配子。该适配子在其随机序列区域能形成特殊的茎环结构，能特异性高亲和力结合肝脏去唾液酸糖蛋白受体大亚基H1蛋白并且能特异性高亲和力靶向结合至肝细胞。本发明专利技术为开发肝脏疾病靶向性诊断试剂与治疗药物提供了新的选择。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属肝脏疾病的诊断与治疗领域。本专利技术涉及利用SELEX技术筛选获得的一种靶向肝细胞的RNA适配子，以及此适配子的核苷酸序列。
技术介绍
慢性肝脏疾病是一种重要而难治的疾病。对于病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等疾病通常需要长期用药治疗，但大多数药物并非特异性作用于肝脏。将药物与肝脏靶向性载体结合，使其选择性靶向到特定的肝细胞，从而使药物更高效地传递到肝脏、更好地发挥药物的治疗作用是极具前景的治疗方案。但是，目前仍然缺乏特异性的靶向肝细胞的载体。肝细胞特异性去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)是肝脏靶向治疗众多作用靶点中研究最多且最有希望的一个靶点。ASGI^R是数量丰富的一种异源低聚物的内吞受体，主要存在于肝脏实质细胞朝向窦状隙一侧的细胞膜表面，又称为肝糖凝集蛋白或肝凝集素。ASGPR在基因靶向递送、靶向药物的研究、临床检测等方面具备很高的应用价值。SELEX 技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment) 是20世纪90年代初-发展起来的一种新的组合化学技术。它利用大容量的随机寡核苷酸库与靶分子相互作用，从中筛选出与靶分子特异结合的寡核苷酸，并结合PCR体外扩增技术，使其得到指数级富集，经过多轮筛选，最终获得高亲和力、高特异性的寡核苷酸适配子。 相对于传统意义上的蛋白质抗体分子，经SELEX筛选得到的寡核苷酸适配子分子更小，免疫原性低，能更快渗入细胞，是极具潜力的预防、诊断和治疗疾病的新型试剂。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种RNA适配子，通过特异性结合肝脏去唾液酸糖蛋白受体来实现肝细胞靶向性，可用于肝脏疾病的诊断与治疗。本专利技术通过以下技术方案实现体外合成一个长度为115核苷酸的含有25个随机序列的单链DNA文库，通过体外转录构建出单链RNA适配子随机文库；采用亲和柱层析的方法，从人肝组织中纯化肝脏 ASGPR，以其大亚基Hl作为靶蛋白，采用SELEX技术筛选具有高亲和力的ASGI3R特异性RNA 适配子；通过结构预测软件RNA Structure Program分析预测适配子的二级结构；通过膜结合测定实验、凝胶阻滞实验鉴定筛选适配子对靶蛋白的特异性和亲和力，得到了一个与 Hl蛋白亲和力高、特异性强的适配子，命名为H1-A25 ；该RNA适配子的RNA序列为5’_GUU GAUUGC ⑶⑶ CAAUCAUGGCGUAGUAAAAGACAAGUAGCUACGAG ⑶ CAUGUGUAU ⑶ UGGGGAUUAGGACCUGAUU GAGUUCAGCCCACAUAC-3’，能形成茎环结构。该适配子能特异性高亲和力结合肝脏去唾液酸糖蛋白受体大亚基Hl蛋白或能特异性高亲和力靶向结合至肝细胞。制备抗RNA酶降解的氟修饰H1-A25，对其进行绿色荧光标记，鉴定其与肝细胞的特异性结合和内吞，结果发现该适配子能通过ASGI5R特异性靶向结合至肝细胞并被细胞内吞，而不结合非肝细胞。本专利技术的优点是1.获得了能够靶向性结合至肝细胞并被内吞的适配子，该适配子可以大量人工制备，方法简单，成本低廉。2.为进一步筛选以RNA适配子为基础的肝脏疾病诊断和治疗药物奠定了基础。 附图说明图1 是SELEX筛选Hl蛋白特异性结合RNA适配子的流程图。图2:是筛选获得的RNA适配子的二级结构分析图。其中图2红色方框内为适配子的随机序列区域，该区域形成了一个特殊的茎环结构。图3 说明了适配子H1-A25能够特异性高亲和力结合ASGI3R大亚基Hl蛋白的结果图。其中图3A部分为适配子H1-A25与Hl蛋白的结合曲线，显示了二者之间结合的高亲和力；B和C两部分分别为适配子H1-A25与Hl蛋白结合的膜结合实验和凝胶阻滞实验， 显示了二者之间结合的高特异性。图4 说明了适配子H1-A25能够通过ASGI3R特异性靶向结合至肝细胞并被细胞内吞的结果图。其中图4A、B和C三部分分别为荧光标记适配子H1-A25与H印G2、Huh7和 HeLa细胞进行的结合实验，结果显示H1-A25能够特异性结合肝细胞；D和E部分分别为用 ASGPR抗体和过量未标记适配子来阻断适配子与H印G2细胞之间的结合，结果显示H1-A25 与肝细胞之间的结合是通过ASGI3R来介导的；F部分为活的H印G2细胞对H1-A25的内吞实验，结果显示了 H1-A25能够被肝细胞内吞。具体实施例方式以下结合说明书附图和实施例对本专利技术作进一步的说明，但不是限制本专利技术。实施例1 :H1蛋白特异性结合RNA适配子的SELEX筛选SELEX筛选过程如图1所示，化学合成初始寡核苷酸随机文库及引物，序列如下 5' -TTAATACGACTCACTATAGTTGATTGCGTGTCAATCATGG-25N-GGTCATGTGTATGTTGGGGATTAGGACC TGATTGAGTTCAGCCCACATAC-3 ‘ (T7启动子序列由下划线标明，25N代表25个随机核苷酸)；应用引物 1 5 ‘ -TTAATACGACTCACTATAGTTGATTGCGTGTCAATC-3 ‘，引物2 :5 ‘ -GTATGTGGGCTGAACTCAAT-3 ‘。将单链DNA文库扩增为双链DNA,产物经2%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。68 μ gRNA文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA 分子，然后与2μ gH137°C孵育40min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液(7mol/L尿素，0. 5mol/L醋酸铵，lmmol/L EDTA,0. 2% SDS)中煮沸 5min,离心，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20 μ 1 DEPCR水中；以RNA为模板 RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到大小为115bp双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转录出97nt的RNA适配子库，筛选共进行12轮。实施例2 =RNA适配子的二级结构分析将第12轮筛选得到的文库克隆至pMD19-T载体，转化至大肠杆菌DH5ci，随机挑选48个克隆，测序。获得所筛选适配子的序列信息，通过结构预测软件RNA Structure Program预测所有测序克隆的RNA 二级结构，获得一种适配子其在随机序列区域(23_47nt) 可以形成一个特殊的茎环结构，如图2所示。实施例3 获得特异性高亲和力的Hl蛋白结合适配子将具有上述二级结构的RNA适配子分别取1 μ g，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP) 37°C 消化lh，纯化回收去磷酸化的RNA ；通过T4多核苷酸激酶标记[Y -32PlATP于去磷酸化的 RNA分子末端。IOnmol放射性标记的RNA适配子分别与不同浓度(10-200nM)的Hl蛋白 37°C孵育40min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行做两次测定。计算各个适配子与Hl蛋白的解离常数，获得亲和力最高的适配子，命名为H1-A25。32P标记的H1本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．靶向肝细胞的ＲＮＡ适配子及其核苷酸序列，其特征在于：该ＲＮＡ适配子的ＲＮＡ序列为：５’－ＧＵＵＧＡＵＵＧＣＧＵＧＵＣＡＡＵＣＡＵＧＧＣＧＵＡＧＵＡＡＡＡＧＡＣＡＡＧＵＡＧＣＵＡＣＧＡＧＧＵＣＡＵＧＵＧＵＡＵＧＵＵＧＧＧＧＡＵＵＡＧＧＡＣＣＵＧＡＵＵＧＡＧＵＵＣＡＧＣＣＣＡＣＡＵＡＣ－３’，能形成茎环结构。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨东亮，杨燕，刘嘉，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属同济医院，
类型：发明
国别省市：83
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