一种木霉滴丸剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于微生物活性农药技术领域。本发明专利技术木霉滴丸剂包含木霉孢子悬浮液和滴丸基质，其中，木霉T1菌株孢子悬浮液是由棘孢木霉菌株T1(Trichoderma?asperellum?T1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC?NO：3531，保藏日期为2009年12月17日)的孢子粉配制，其rDNA?ITS区片段序列如SEQ?ID?NO：1所示；本发明专利技术还含有浓度为0.5～1.5g/L孢子悬浮液的防腐剂。滴丸基质为聚乙二醇1000、聚乙二醇2000和聚乙二醇4000中的一种或二种或三种的混合物。本发明专利技术木霉滴丸剂具备含药量大、生物活性高、成型效果好、能在最短时间内溶散、便于贮藏、运输和使用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物活性农药
，具体涉及一种木霉滴丸剂及其制备方法和应用。
技术介绍
木霉菌隶属于半知菌亚门，丛梗目，从梗孢科，是一类具有重要经济意义的生防益 菌。木霉菌对环境的适应性强、生长速度远比病原真菌快、是土壤中植物病原真菌生存空间 和营养源的有力竞争者。木霉菌能有效地利用植物表面或植物病原真菌侵入点附近低浓度 营养物质迅速占领空间吸收营养使植物病原真菌无法入侵。近年来人为向土壤中引入木霉 菌防治植物病害的研究较为活跃，例如用哈茨木霉、哈氏木霉和绿色木霉防治洋葱白腐病、 棉花和黄瓜黄萎病、人参根腐病、茉莉白绢病、西洋参立枯病及多种作物的猝倒病和疫病， 均取得较为理想的防治效果。不同种类木霉菌有不同的植物病害防治功效，但目前尚未有 将木霉菌滴丸剂用于防治香蕉枯萎病的技术记载。木霉菌分生孢子的产生对条件要求不严格，便于开发生防制剂，并且木霉对病原 菌的拮抗作用以分生孢子产生的抑菌物质最为明显。木霉菌经固体发酵后可产生大量的分 生孢子，目前常用的木霉分生孢子制剂有粉剂、颗粒剂等，但是这些制剂田间施用时缓释作 用比较差，不能在相对长的一段时间内发挥其生防活性，且易受到环境的影响。滴丸剂是固体分散体的成熟剂型之一，采用滴制法将固体或液体药物与基质加热 熔化制备成液体分散体后，滴入到与基质不相溶的冷凝液中收缩冷凝成丸剂。滴丸剂制备 工艺具有生物利用度高、能延缓释药、增加药物稳定性和掩盖药物的不良气味及刺激性、生 产设备及操作简便等特点。滴丸剂主要应用于医药工业，在微生物农药领域的应用未见报 道。鉴于滴丸技术的诸多优点，将滴丸技术应用到微生物活性农药制备领域，借以解 决微生物制剂在复杂的田间难以保持生物活性以及缓慢释放的难题。但滴丸制剂的载药量 与滴丸成型密切相关，加工温度也必须严格控制，以防高温条件下微生物容易失去活性。到 目前为止滴丸技术在微生物活性农药制备领域尚未被合理应用。
技术实现思路
本专利技术目的在于根据医药制剂加工领域比较成型的滴丸制备技术，结合微生物活 体木霉分生孢子在其制备方法中存在的需要注意的问题，将滴丸技术合理用于微生物活性 农药制备，提供一种易加工保存，缓释效果好的木霉滴丸剂。本专利技术另一目的在于提供上述木霉滴丸剂的制备方法。本专利技术还有一个目的在于提供上述木霉滴丸剂的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案予以实现一种木霉滴丸剂，包含木霉孢子悬浮液和滴丸基质，其中，木霉孢子悬浮液是棘孢 木霉菌株T1 (Trichoderma asperellum,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC N0:3531，保藏日期 为2009年12月17日)固体培养之后无菌水洗脱下来的孢子悬浮液，其rDNA ITS区片段 序列如SEQ ID NO 1所示。本专利技术木霉滴丸剂是具有萌发活性的分生孢子制剂，其rDNA ITS区片段序列可以 通过PCR扩增得到，扩增引物序列如SEQ ID NO :2 3所示，PCR反应体系为ddH20 14. 8 μ L， 10XPCR buffer (with Mg2+) 2.5 μ L，dNTPs(10mM each) 0. 5 μ L 上游引物(5 μ Μ) 3.0 μ L，下 游引物(5 μ Μ) 3. 0 μ L，模板 DNA 1. 0μ L, Taq 酶 0.2 μ L。PCR 反应条件为(1) 94°C，5min， 热变性；(2)94°C，4k，热变性；(3)55°C，妨s，退火；(4)72°C，4k，延伸；(5) 72°C，lOmin，延 伸；其中(2)、⑶、⑷是循环。扩增出的序列如SEQ ID NO 1所示。上述木霉滴丸剂中还含有防腐剂，防腐剂可选择水杨酸、山梨酸钾和苯甲酸钠中 的一种或多种的混合，防腐剂的浓度为0. 5 1. 5g/升孢子悬浮液。所述的滴丸基质为聚乙二醇1000、聚乙二醇2000和聚乙二醇4000中的一种或二 种或三种的混合。所述木霉孢子悬浮液与基质的体积比为1 10 3 10。本专利技术木霉孢子滴丸剂的制备方法包括如下步骤(1)将棘孢木霉菌株T1植于PDA培养基上使其复苏，再采用酵母膏蔗糖培养基进 行菌种继代培养，待长出直径为5 7mm的深绿色菌落后，将菌落接种，在酵母膏蔗糖培养 基和麸皮木屑培养物中进行扩大培养，直至长出白色菌丝或绿色孢子；(2)将白色菌丝或绿色孢子制成孢子悬浮液，过滤沉淀为浓缩孢子液；(3)向浓缩孢子悬浮液中添加防腐剂，溶解搅拌均勻，即得木霉滴丸剂原药；(4)将滴丸基质预热至熔化状态；注入冷凝剂至滴丸机中并设置温度进行预冷；(5)将木霉滴丸原药迅速加入预热的滴丸基质中，然后将混合液加入滴丸机的储 液罐中，打开搅拌器，待储液罐的油浴温度稳定后，调整滴距打开滴头开始滴丸，即得木霉 滴丸剂。上述制备方法中，所述酵母膏蔗糖培养基为高温灭菌过的培养基，灭菌温度为 121°C，灭菌时间为30min，酵母膏蔗糖培养基的配方为酵母膏15g，蔗糖20g，KH2PO4Ig,麦 芽膏15g，硫酸钠2g，氯化钾0. 5g，维生素B 0. 5mg,维生素C 0. 5mg,七水合硫酸镁0. 05g, 硫酸铁0. Olg，琼脂20g，水IL0步骤(1)中所述菌种继代培养的温度为30°C，湿度为70 85%，培养时间为48 72h ；所述扩大培养的温度为30°C，湿度为70 85%，培养时间为5 7d。所述麸皮木屑培养物是麸皮、木屑、蔗糖、维生素B和水的混合物，其中，麸皮、木 屑、蔗糖三者的质量比为2 1 0.02;维生素B用量为每千克麸皮木屑培养物中加入 0. 5mg，每瓶装瓶量为15g;每瓶加水量5ml ；防腐剂为水杨酸、山梨酸钾和苯甲酸钠中的一 种或多种的混合，用量为0. 5 1. 5g/L孢子悬浮液；用于酵母膏蔗糖培养基和麸皮木屑培 养物灭菌的温度为121°C，灭菌时间为30min。步骤(4)所述木霉滴丸的基质为聚乙二醇1000、聚乙二醇2000和聚乙二醇4000 中的一种或二种或三种的混合；原药与熔化的基质按照体积质量比1 10 3 10混合； 冷凝剂可选择液体石蜡或二甲基硅油或植物油，冷凝温度为0°C;步骤(5)中药液的油浴温度为53 57°C，搅拌速度为20 300转/分钟，滴距为Mem。上述木霉滴丸剂用于防治香蕉枯萎病。木霉菌对环境的适应性强且生长速度远比病原真菌快，能对病原真菌产生营养或 空间的竞争，能有效利用植物表面的病原真菌侵入点附近的低浓度营养物质迅速生长占领 空间消耗掉营养物质，从而抑制了病原真菌的生长和对寄主植物的入侵，达到对植物病害 的防治效果。本专利技术木霉滴丸剂作为微生物活性农药，不仅能有效防治香蕉枯萎病，还因为棘 孢木霉菌株T1具有广谱性拮抗能力，因此本专利技术木霉滴丸剂能拮抗多种病原真菌，防治其 他多种植物病害。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果(1)本专利技术采用棘孢木霉菌株T1作为生产菌株，其孢子粉生存能力强，适应性广， 具有广谱性拮抗能力，除了能对香蕉枯萎病起到有效防治，还能够拮抗多种病原真菌，尤其 对土传真菌有显著的拮抗效果。(2)本专利技术将滴丸技术合理用于微生物活性农药木霉滴丸剂的制备中，解决了田 间复杂条件下难以保持微生物活性以及本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种木霉滴丸剂，其特征在于：包含木霉孢子悬浮液和滴丸基质，其中，木霉孢子悬浮液是由棘孢木霉菌株Ｔ１（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ　Ｔ１，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为ＣＧＭＣＣ　ＮＯ：３５３１，保藏日期为２００９年１２月１７日）的孢子粉制备，其ｒＤＮＡ　ＩＴＳ区片段序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：方羽生，张颂声，周俐，钟平生，詹玉海，李小妮，高永峰，陈树华，蒋刚彪，李静美，
申请(专利权)人：惠州市南天生物科技有限公司，华南农业大学，广东省植物保护总站，
类型：发明
国别省市：44