一种木霉孢子粉剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种木霉孢子粉剂及其制备方法和应用。本发明专利技术木霉孢子粉剂包含木霉孢子粉和助干剂，其中，木霉孢子粉是棘孢木霉菌株Ｔ１（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ　Ｔ１，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为ＣＧＭＣＣ　ＮＯ：３５３１）的孢子粉，其ｒＤＮＡ　ＩＴＳ区片段序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１所示，所述助干剂为β－环糊精、马铃薯淀粉、可溶性淀粉中的一种或几种的混合物。本发明专利技术木霉孢子粉剂可以对香蕉枯萎病起到有效防治的效果，还可以拮抗多种病原真菌，尤其对土传真菌有显著的拮抗效果。本发明专利技术制备方法节省了木霉孢子粉剂的制备时间，得到的木霉孢子粉剂密度大、萌发率高，干燥效率高，便于贮藏、运输和使用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物活性农药粉剂，具体涉及一种木霉孢子粉剂及其制备方法和应用。
技术介绍
木霉菌隶属于半知菌亚门，丛梗目，从梗孢科，是一类具有重要经济意义的生防益 菌。木霉菌对环境的适应性强、生长速度远比病原真菌快、是土壤中植物病原真菌生存空间 和营养源的有力竞争者。木霉菌能有效地利用植物表面或植物病原真菌侵入点附近低浓度 营养物质迅速占领空间吸收营养使植物病原真菌无法入侵。近年来人为向土壤中引入木霉 菌防治植物病害的研究较为活跃，例如用哈茨木霉、哈氏木霉和绿色木霉防治洋葱白腐病、 棉花和黄瓜黄萎病、人参根腐病、茉莉白绢病、西洋参立枯病及多种作物的猝倒病和疫病， 均取得较为理想的防治效果。不同种类木霉菌有不同的植物病害防治功效，但目前尚未有 将木霉菌用于防治香蕉枯萎病的技术记载。木霉菌经固体发酵后可产生大量的孢子，人们通常将大量的木霉菌孢子制成木霉 孢子粉剂以便于对其进行贮藏、运输和施用。目前常用的木霉孢子粉剂制备方法是用水将 木霉孢子从固体培养基上洗脱下来制成孢子悬浮液，在孢子悬浮液中加入适量吸水剂后将 其在室内晾干或用低于50°C的温度风干制成木霉孢子粉剂。但这种制备方法加工时间长、 效率低、体积大且晾干或风干后的木霉孢子粉剂中木霉孢子的密度较低，不便于贮藏、运输 和施用。喷雾干燥技术是指采用雾化法将原料液分散为雾滴并用热气体干燥雾滴而获得干 粉产品的一种干燥方法。由于成本低、易于推广、采用的设备简单且有利于干粉产品的大 规模连续生产，喷雾干燥技术在食品、化工、医药、环保等领域的运用颇为广泛。鉴于喷雾干 燥技术的诸多优点，人们曾试图将喷雾干燥技术应用到微生物活性农药制备领域，借以解 决微生物粉剂难以在保持高活性的前提下快速制备的难题。但喷雾干燥技术的温度参数通 常在140°C以上，在此高温条件下微生物容易失去活性。如木霉孢子在超过45°C的温度条 件下容易失活，孢子悬浮液中的木霉孢子通过高温高压喷嘴喷出后基本丧失萌发能力。因 为人们尚未找到如何在干燥喷雾技术的高温条件下保持微生物活性的解决方案，到目前为 止喷雾干燥技术在微生物活性农药制备领域尚未被合理应用。
技术实现思路
本专利技术目的在于根据现有木霉孢子及其制备方法中存在的不足，将喷雾干燥技术 合理用于微生物活性农药制备，提供一种粉剂密度大，萌发率高，干燥效率高的木霉孢子粉 剂。本专利技术另一目的在于提供上述木霉孢子粉剂的制备方法。本专利技术还有一个目的在于提供上述木霉孢子粉剂的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案予以实现一种木霉孢子粉剂，包含木霉孢子粉和助干剂，其中，木霉孢子粉是棘孢木霉菌株3T1 (Trichoderma asperellum T1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为CGMCCNO :3531，保藏日期为2009年12月17日)的孢子粉，其rDNA ITS区片段 序列如SEQ ID NO 1所示。本专利技术木霉孢子粉是具有萌发活性的孢子粉，其rDNA ITS区片段序列可以通过 PCR扩增得到，扩增引物序列如SEQ ID NO :2 3所示，PCR反应体系为ddH20 14. 8 μ L， 10XPCR buffer (with Mg2+) 2.5 μ L，dNTPs(10mM each) 0. 5 μ L 上游引物(5 μ Μ) 3.0 μ L，下 游引物(5 μ Μ) 3. 0 μ L，模板 DNA 1. 0μ L, Taq 酶 0.2 μ L。PCR 反应条件为(1) 94°C，5min， 热变性；(2)94°C，4k，热变性；(3)55°C，妨s，退火；(4)72°C，4k，延伸；(5) 72°C，lOmin，延 伸；其中(2)、⑶、⑷是循环。扩增出的序列如SEQ ID NO 1所示。上述木霉孢子粉剂中，所述助干剂为β-环糊精、马铃薯淀粉、可溶性淀粉中的一 种或几种的混合物。本专利技术木霉孢子粉剂的制备方法包括如下步骤(1)将棘孢木霉菌株T1植于PDA培养基上使其复苏，再采用酵母膏蔗糖培养基进 行菌种继代培养，待长出直径为5 7mm的深绿色菌落后，将菌落接种，在酵母膏蔗糖培养 基和麸皮木屑培养物中进行扩大培养，直至长出白色菌丝或绿色孢子；(2)将白色菌丝或绿色孢子制成孢子悬浮液，过滤沉淀为浓缩孢子液；(3)向浓缩孢子液中添加助干剂，每升孢子液中加入助干剂的质量为50g，一边搅 拌一边喷雾干燥，即得木霉孢子粉剂。上述制备方法中，所述酵母膏蔗糖培养基的最佳配方为酵母膏15g，蔗糖20g， KH2PO4Ig,麦芽膏15g，硫酸钠2g，氯化钾0. 5g，维生素BO. 5mg,维生素CO. 5mg,七水合硫酸 镁0. 05g，硫酸铁0. Olg,琼脂20g,水IL0上述酵母膏蔗糖培养基优选高温灭菌过的培养基，灭菌温度为121°C，灭菌时间为 30mino所述菌种继代培养的温度优选为30°C，湿度为70 85%，培养时间为48 72h。所述扩大培养的温度优选为30°C，湿度为70 85%，培养时间为5 7d。所述麸皮木屑培养物是麸皮、木屑、蔗糖、维生素B和水的混合物，其中，麸皮、木 屑、蔗糖三者的质量与水的体积比为2 1 0.02，维生素B用量为每千克麸皮木屑培养物 中加入0. 5mg。步骤C3)所述喷雾干燥是将浓缩孢子液添加助干剂后在磁力搅拌器上一边搅拌 一边进行喷雾干燥，在90 130°C范围内设定进风温度、出风温度在41 55°C，控制进料 量为1 20wt %。作为一种优选方案，喷雾干燥过程中进风温度为110°C，出风温度为53°C， 进料量为IOwt %。由于木霉菌对环境的适应性强且生长速度远比病原真菌快，能对病原真菌产生营 养或空间的竞争，能有效利用植物表面的病原真菌侵入点附近的低浓度营养物质迅速生长 占领空间消耗掉营养物质，从而抑制了病原真菌的生长和对寄主植物的入侵，达到对植物 病害的防治效果。本专利技术木霉孢子粉剂作为微生物活性农药，不仅能有效防治香蕉枯萎病， 还因为棘孢木霉菌株T1具有广谱性拮抗能力，能拮抗多种病原真菌，防治其他多种植物病 害。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果(1)本专利技术采用棘孢木霉菌株T1作为生产菌株，其孢子粉生存能力强，适应性广， 具有广谱性拮抗能力，除了能对香蕉枯萎病起到有效防治，还能够拮抗多种病原真菌，尤其 对土传真菌有显著的拮抗效果；(2)本专利技术将喷雾干燥技术合理用于微生物活性农药木霉孢子粉剂的制备中，解 决了干燥喷雾技术的高温条件下难以保持微生物活性的技术难题，使得微生物粉剂可以在 保持高活性的前提下快速制备，制备工艺简单易行，采用的设备简单，有助于降低干粉产 品的制备成本，易于推广，有利于干粉产品的大规模连续生产，节省了孢子粉剂的制备时 间；(3)本专利技术木霉孢子粉剂木霉孢子密度大，萌发率高，干燥效率高，贮藏空间小，方 便人们对其进行贮藏、运输和使用。具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。实施例11.菌株的复苏和扩大培养(1)将冷藏的棘孢木霉菌株Tl (Trichoderma asperellum T1)植于PDA培养基上 使其复苏； (2)采用酵母膏蔗糖培养基，并设定培养温度为30°C、湿度为70 85%，对经过步 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种木霉孢子粉剂，其特征在于包含木霉孢子粉和助干剂，其中，木霉孢子粉是棘孢木霉菌株Ｔ１（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ　Ｔ↓［１］，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为ＣＧＭＣＣ　ＮＯ：３５３１）的孢子粉，其ｒＤＮＡ　ＩＴＳ区片段序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：方羽生，钟平生，张颂声，赵瑾，詹玉海，周俐，蒋刚彪，李小妮，高永峰，
申请(专利权)人：惠州市南天生物科技有限公司，华南农业大学，广东省植物保护总站，
类型：发明
国别省市：44[]