一种快速检测灵芝孢子粉中孢子值的方法技术

本发明专利技术涉及真菌孢子破壁情况的测定方法，尤其是灵芝孢子的孢子值的测定方法。本发明专利技术为一种测定灵芝孢子的孢子值的方法，其要点在于取待测孢子粉B制得适当的悬浮液，定容后，混合均匀，在具C6目镜测微尺的显微镜下观察统计单位视野完整孢子数与破壁孢子数，计算出孢子值即完整孢子数占完整孢子数与破壁孢子数总和的百分比值。本发明专利技术的优点在于利用C6测微尺对分散均匀的孢子粉完整孢子和破壁孢子的面积进行计数，达到了操作简单、价格低廉、检测结果具有代表性的目的。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】
本专利技术涉及一种真菌孢子粉中孢子值检测方法，尤其是能快速检测灵芝孢子破壁 后且无同批次未破壁灵芝孢子粉中的孢子值，属于中药领域。
技术介绍
灵芝孢子是灵芝在生长成熟期，从灵芝菌褶中弹射出来的及其微小的卵形生殖细 胞，及灵芝的种子。它凝聚了灵芝的精华，具灵芝的全部遗传物质和保健作用。灵芝孢子粉 的外壳包括两层由十分坚硬的几丁质和葡聚糖构成的孢壁；孢壁质地坚硬，具有耐酸碱、抗 氧化、耐压抗热、耐酶抗消化等性质，限制了人体对灵芝孢子内营养成分的吸收利用。孢壁 破碎或消除之后，由孢壁所紧裹的有效成分才能最大程度地被人体肠胃直接吸收。有资料 表明，破壁的灵芝孢子粉有利于三萜、粗多糖、粗脂肪等成分的溶出，其中粗多糖含量比未 破壁灵芝孢子粉高出70%。若直接食用未破壁的灵芝孢子粉，人体仅能利用12%左右的有效 成分，而服用破壁后的灵芝孢子粉，有效成分利用率可达95%以上。因此，破壁灵芝孢子粉 的破壁率的大小就是能否最大程度上利用灵芝孢子粉有效成分的关键所在。对于市场上众 多的灵芝孢子粉，破壁率常被作为衡量这种产品质量的重要指标。 目前，破壁灵芝孢子粉的质量标准主要是破壁率，破壁率的测定主要参考农业部 标准《NY/T1677-2008破壁灵芝孢子粉破壁率的测定》以及国家标准《GB/T29344-2012灵 芝孢子粉采收加工技术规范》附录A "破壁灵芝孢子粉破壁率的测定方法"。在这两个标准 中，破壁率测定原理都是通过血球计数板对未破壁的孢子进行计数，然后计算出单位重量 所含完整孢子的数量，利用公式 孢子破壁率（％) =( 1-破壁后完整的孢子/破壁前完整的孢子）X 100% 计算出孢子的"破壁率"。需建立灵芝孢子粉质量与孢子个数之间的标准曲线，利用此 标准曲线确定同批次一定质量待测破壁孢子粉中未破壁孢子粉的孢子个数，获得破壁孢子 粉的破壁率。但是，此种方法需同批次待测破壁孢子粉中未破壁孢子粉，而实际生活中消费 者购买的均为破壁灵芝孢子粉，无法获得同批次未破壁灵芝孢子粉，进而无法对其破壁率 进行检测，因而本专利技术提出检测其孢子值。 除血球计数板法外，目前公开报道的破壁率的测定方法还有水装片结合显微技术 的方法、悬浮法结合物理技术检测方法以及化学指纹检测方法。但化学成分分析方法的检 测步骤复杂，所用仪器昂贵，检测成本较高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术中的不足之处，提供一种使孢子平均分散程 度较高，较为精确的测定破壁灵芝孢子粉孢子值的方法。孢子值即为破壁灵芝孢子粉中的 完整孢子数占完整孢子数与破壁孢子数总和的百分比值。由于破壁孢子数无法计数，采用 C6型目镜测微尺，对其面积进行计数，小格内含物质超过1/2记为1个小格，不满1/2记为 〇个小格，恰好1/2则记为0. 5个小格。分别对未破壁灵芝孢子和已破壁灵芝孢子计数，未 破壁灵芝孢子数占未破壁灵芝孢子数与已破壁孢子数总和的平均百分比值，即为孢子值。 本专利技术为一种快速检测灵芝孢子的孢子值的方法，其特征在于： (1) 取待测孢子值的灵芝孢子粉B，烘干至恒重，并使用一定量的水合氯醛试液与玻璃 研钵上多次轻柔研匀，超声混匀，后定容至相同体积，混合均匀，得到相应的悬浮液； (2) 取上述灵芝孢子粉悬浮液点滴在载玻片上，在显微镜下，使用C6型目镜测微尺，分 别读出完整孢子及破碎孢子所占小格数；小格内含完整孢子或破碎孢子超过1/2记为1个 小格，不满1/2记为0个小格，恰好1/2则记为0. 5个小格；利用公式 孢子值（％)=X 100% 计算出孢子值；其中，孢子值是指破壁灵芝孢子粉中的完整孢子数占完整孢子数与破 壁孢子数总和的百分比值，完整孢子数是指完整孢子所占的格子，破壁孢子数是指破碎孢 子所占的格子。且以孢子粉A的孢子值为评判标准。 本专利技术选用混悬液为水合氯醛，在孢子粉分散均匀后，定量点样于载玻片，经试验 比对，选用水合氯醛试液孢子粉的分散效果较硫酸锌试液等效果好，因其密度和黏度有利 于孢子在悬浮液中的物理稳定性，但这不是本专利技术最重要的原因。 为了计量准确，所使用的破壁孢子粉需为未添加任何辅料的破壁灵芝孢子粉，且 应除去杂质，60°C烘干至恒重。 为了增加孢子在水合氯醛中的分散性和减少孢子重新聚集，在定容后进行机械搅 拌，如超声混匀。 由于孢子破壁后，单个视野中所含完整的未破壁的孢子数较少，为了计量准确，所 取的破壁孢子粉的量应适当增多，若孢子粉量太多，载玻片上破壁孢子粉聚集，视野下不能 形成单层孢子粉。 本专利技术的优点在于利用同一孢子粉破壁与完整孢子数固定不变，在孢子粉悬浮液 中均匀分散，从而达到了技术精确，操作简单低廉，检测结果具有代表性的目的。【附图说明】 图1显微镜下在硫酸锌乙醇溶液里的孢子分布状态（注：A.未破壁灵芝孢子； B.破壁灵芝孢子）。 图2显微镜下在本专利方法处理后的未破壁孢子分布状态（注：A.未破壁灵芝 孢子；B.破壁灵芝孢子）。 图3显微镜下在本专利方法处理后的破壁孢子分布状态（注：A.未破壁灵芝孢 子；B.破壁灵芝孢子）。 图4显微镜下C6目镜测微尺中孢子分布状态（注：A.未破壁灵芝孢子；B.破 壁灵芝孢子）。 图5实施例1中样本的孢子值分析结果。 图6实施例2中样本的孢子值分析结果。 图7实施例3中样本的孢子值分析结果。 图8实施例4中样本的孢子值分析结果。【具体实施方式】 以下进一步说明本专利技术的具体步骤及条件： 实施例1: 1、制备孢子悬浮液 (1)取4份(分别来源于不同厂家或同一厂家不同批次的样品，见表1，样品编号为 P01-P04)适量的已知破壁率的灵芝孢子粉A (破壁率3 98%)和市售未知破壁率孢子粉B (孢子粉B采用常规方法，即国家标准《GB/T29344-2012灵芝孢子粉采收加工技术规范》附 录A "破壁灵芝孢子粉破壁率的测定方法"，测得其破壁率>98% ;见表1，样品编号为P05)， 在烘箱60°C下烘干5小时。 (2)精确定量称取经烘干的孢子粉A和B (W=0. 04g)。 (3)将上述孢子粉放入直径5mm的玻璃研钵，用水合氯醛试液少量多次轻轻研匀 孢子粉尽量使其团块分散，并用水合氯醛定容到5ml容量瓶中，再超声20min，使孢子在悬 浮液中充分分散。 2、观察与计数 (1)用移液枪吸取10 y 1上述检测用孢子悬浮液，置于盖玻片的边缘，使液体缓缓渗 入，多余的液体用吸水纸吸除，稍等片刻后，在400倍显微镜下观察孢子，如图2、3所示，孢 子平均分散。 (2)在10X40倍数的显微镜下，分别读取C6测微尺上5X5mm2大格中完整孢子数 和破壁孢子当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测灵芝孢子粉中孢子值的方法，其特征在于：取待测的灵芝孢子粉B，烘干至恒重，并用一定量的水合氯醛试液与玻璃研钵上多次轻柔研匀，超声混匀，后定容至相同体积，混合均匀，得到相应的悬浮液；取上述灵芝孢子粉悬浮液点滴在载玻片上，在显微镜下，使用C6型目镜测微尺，分别读出完整孢子及破碎孢子所占小格数；其中，小格内含完整孢子或破碎孢子超过1/2记为1个小格，不满1/2记为0个小格，恰好1/2则记为0.5个小格；利用公式孢子值（%）=×100%计算出孢子值；其中，孢子值是指破壁灵芝孢子粉中的完整孢子数占完整孢子数与破壁孢子数总和的百分比值，完整孢子数是指完整孢子所占的格子，破壁孢子数是指破碎孢子所占的格子。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：梁晓霞，范巧佳，贺翠，熊诚，费文波，潘燕，苑莉莉，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51