转录因子ORCA3和关键酶G10H双基因共转化提高喜树碱含量的方法技术

本发明专利技术是一种生物技术领域的提高喜树毛状根中喜树碱含量的方法。从长春花中克隆出CrORCA3和CrG10H基因的编码框序列，构建含上述基因的植物双价高效表达载体，以发根农杆菌介导法遗传转化喜树获得转CrORCA3和CrG10H基因的喜树毛状根。本发明专利技术获得的转基因喜树毛状根中喜树碱含量显著提高，喜树碱含量为对照的5.4倍，羟基喜树碱含量为对照的2.3倍。单独转CrORCA3基因的毛状根喜树碱含量比对照提高了1.5倍，单独转CrG10H基因的毛状根喜树碱含量并无明显提高。本发明专利技术提供了一种提高喜树毛状根中喜树碱含量的方法，也为生产具重要临床需求的抗癌药物喜树碱和羟基喜树碱提供了一种新方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是一种生物
，特别是一种转录因子0RCA3和关键酶GlOH双基因共转化代谢工程策略提高喜树毛状根中喜树碱含量的方法。
技术介绍
喜树碱(Camptothecin，CPT)是最早从中国特有的喜树(Camptotheca acuminata)中提取出来的一种具有显著抗肿瘤活性的生物碱。现有多种喜树碱类药物如依立替康(Irinotecan)和拓扑替康(Topotecan)获得美国FDA(199》认证，在临床上被广泛用于治疗卵巢癌、直肠癌及白血病等多种恶性肿瘤，全球市场需求十分巨大。目前世界上喜树碱类药物的生产主要是从喜树等植株中提取，然而由于喜树天然资源数量有限，生长十分缓慢，喜树碱及其类似物在植物体内含量又非常低，且提取环节多、费时费力，所以从天然喜树中提取喜树碱的方法已远远不能满足人们对喜树碱日益增长的需求。多年来，国内外学者围绕着扩大喜树碱药源问题进行了诸多领域的研究如化学全合成，半合成及细胞培养等，并取得了一定的进展。喜树碱的化学全合成虽然已经成功， 但因成本太高、产量太低、周期太长且易造成环境污染等因素而限制了其商业化生产；半合成方法虽然是目前最有效的途径之一，但其前体的提取分离仍然依赖于天然资源的供应；细胞悬浮培养则存在喜树碱含量低微及稳定性较差等问题同样难以实现工业化生产 (Hengel et al 1992)。相比之下，利用基因工程技术将喜树碱生物合成途径中的关键酶基因导入产喜树碱的资源植物中，继而获得转基因的发根系或再生植株等，并进行大规模的培养是实现从根本上提高喜树碱含量的最佳途径之一(Lorence and Nessler2004, Lu et al 2008)。大量研究表明，异胡豆苷合成酶(STR)，色氨酸脱羧酶(Tryptophan decarboxylase, TDC)，香叶醇-10-脱氢酶即栊牛儿醇-10-羟化酶(Geraniol 10-hydroxylase, GlOH)及 1_ 脱氧木酮糖 _5_ 磷酸合成酶(l-Deoxy-D-Xylulose 5-Phosphate Synthase, DXS)等关键酶在包括喜树碱在内的TIAs的生物合成中具有重要作用(Canel et al 1998 ；De Luca et al 1989 ； Lopez -Meyer 1997 ；Yamazaki et al 2003 ；McKnight et al 1990 ；Kutchan 1989 ；Yamazaki et al 2003 ；Lu et al 2008)。另外，近年来转录因子正逐渐被认为是一种能有效地调控植物次生代谢途径的新手段。通过超量表达转录因子，能够有效地克服多基因共转化存在的弊端，全面上调能被其调控的相关基因的表达水平，对整个次生代谢途径的调控效果要比单纯依赖单个(或多个)结构基因的增强表达好得多。例如van der Fits和MemelinkQ000)在SCIENCE 上报道发现一个受茉莉酸甲酯诱导并能够调控植物初级和次生代谢的中央转录调控因子 0RCA3(Octadecanoie-responsive Cantharanthus AP2-domain protein 3)，會邑增强TIAs生物合成代谢途径中绝大多数催化酶基因的协同表达，从而有效地调控长春花 (Catharanthus roseus)中TIAs的生物合成，充分展示了用转录调节因子来调控TIAs生物合成的巨大潜力。0RCA3的发现为调控喜树碱的代谢合成提供了一种新的研究切入点。必须指出的是转录因子并非万能的，单转化一个0RCA3基因，虽然可以调控诸如AS，TDC，DXS， CPR和STR等多个关键酶基因的协同表达，但是有些基因如关键酶基因GlOH并不受0RCA3 的调控。在0RCA3基因过量表达的细胞中由于关键酶基因GlOH的表达不足，从而限制了 TIA代谢终产物如长春碱的产量没有得到显著提高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服常规技术中的不足，提供一种有效提高喜树毛状根中喜树碱含量的方法。本专利技术还提供了实现上述方法的重组载体。本专利技术利用已克隆的长春花Cr0RCA3和CrGlOH基因，构建含上述基因的植物双价高效表达载体，以发根农杆菌(如C58C1等)为介导，将Cr0RCA3和CrGlOH基因同时导入喜树下胚轴中并再生出毛状根；PCR和荧光定量PCR检测目的基因Cr0RCA3和CrGlOH的整合和表达情况，高效液相色谱测定喜树转基因毛状根中喜树碱含量。技术方案为一种用于提高喜树碱含量的重组载体，含有转录因子基因Cr0RCA3 和香叶醇-10-脱氢酶基因CrGlOH。转录因子0RCA3和关键酶GlOH双基因共转化提高喜树碱含量的方法，包括如下具体步骤(1)将转录因子基因(Cr0RCA3 基因，SEQ ID NO. 1，GenBank :EU072424. 1)和香叶醇-10-脱氢酶基因(CrGlOH基因，SEQ ID NO. 2，GenBank :AJ251269. 1)插入植物表达载体，构建重组载体；以长春花幼苗RNA为模板PCR获得Cr0RCA3和CrGlOH基因片段；植物表达载体可选用pCAMBIA质粒或pBI质粒，尤其是pCAMBIA1304质粒；(2)将步骤(1)所获得的重组载体转入发根农杆菌，构建含有重组载体的发根农杆菌；发根农杆菌可选用发根农杆菌菌株C58C1、发根农杆菌菌株A4或发根农杆菌菌株 L BA9402 ；(3)利用所构建的含有重组载体的发根农杆菌菌株遗传转化喜树，优选为喜树下胚轴，获得毛状根；(4)检测步骤(3)毛状根中的Cr0RCA3和CrGlOH基因，取筛选结果为阳性的转基因毛状根克隆；检测方法为PCR 及 Southern blotting 检测。PCR阳性的转基因毛状根克隆进行Southern blot检测，证明目的基因Cr0RCA3和 CrGlOH已整合到喜树毛状根基因组中；荧光定量PCR测定Cr0RCA3和CrGlOH在喜树转基因毛状根中的表达情况；高效液相色谱法测定喜树转基因毛状根中喜树碱含量，进一步筛选喜树碱和羟基喜树碱含量显著提高的喜树转基因毛状根株系。所述的PCR检测中，分别在植物表达载体上启动插入基因(Cr0RCA3，CrGlOH)表达的组成型表达启动子CaMV35S的内部及插入基因的内部设计上游及下游特异性引物进行DNA的PCR扩增，紫外线下观察到目的条带的株系即为阳性转基因毛状根株系。所述的荧光定量PCR检测Cr0RCA3和CrGlOH基因的表达情况，具体方法为对经 PCR鉴定为阳性的毛状根克隆进行总RNA的提取并反转成cDNA第一条链，分别设计插入目的基因及看家基因ISSrRNA的引物，进行荧光定量PCR扩增，用相对定量法分析Cr0RCA3和 CrGlOH基因的相对表达量。本专利技术的双关键酶基因共转化策略提高喜树毛状根中喜树碱含量的方法，采用基因工程方法，将双关键酶基因(Cr0RCA3，CrGlOH)导入喜树下胚轴中，获得了高产喜树碱的喜树毛状根株系。共转Cr0RCA3及CrGlOH基因的毛状根中所检测的喜树碱和羟基喜树碱含量相比于对照组显著提高，是对照组毛状根(非转基因型)的5. 4倍和2. 3倍。将一些常规生物学实验方本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．转录因子ＯＲＣＡ３和关键酶Ｇ１０Ｈ双基因共转化提高喜树碱含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：（１）将转录因子基因ＣｒＯＲＣＡ３和香叶醇－１０－脱氢酶基因ＣｒＧ１０Ｈ插入植物表达载体，构建重组载体；（２）将步骤（１）所获得的重组载体转入发根农杆菌，构建含有重组载体的发根农杆菌；（３）利用所构建的含有重组载体的发根农杆菌菌株遗传转化喜树，获得毛状根；（４）检测步骤（３）毛状根中的ＣｒＯＲＣＡ３和ＣｒＧ１０Ｈ基因，取筛选结果为阳性的转基因毛状根克隆。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：开国银，李姗姗，王伟，付雪晴，尤丽佳，
申请(专利权)人：上海师范大学，
类型：发明
国别省市：31