本发明专利技术涉及多种支原体单克隆抗体的制备方法及多联免疫检测试剂，其特征在于，将肺炎支原体、人型支原体、溶脲脲原体分别免疫小鼠，进行细胞融合和克隆化，制备出特异性强且效价高的三种单克隆抗体。将以上单克隆抗体以一定比例混合制备成支原体多联免疫检测试剂，用以检测以上几种支原体感染性疾病，该试剂能快捷准确的检出支原体病，取样避免抽血不给病人带来痛苦。为患者得到及时、有效治疗提供保证。该试剂制备和使用过程不产生有害的废气、废水，也不会给患者及操作者带来任何损害，是一种环保、安全、准确、灵敏的生物制剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及多种单克隆抗体的制备方法及应用。
技术介绍
肺炎支原体是人类尤其是儿童呼吸道及肺部感染的重要病原体，占呼吸道及肺部感染人群30% 40%。溶脲脲原体(解脲支原体)和人型支原体是泌尿生殖道感染的重要病原体，占泌尿生殖道感染人群的35% 45%。支原体是一种无细胞壁的体积最小的原核细胞型微生物。因为支原体无细胞壁，支原体感染病用药治疗与细菌、病毒感染病的治疗存在明显差别，只有早期准确鉴别诊断才能对该病进行及时有效的治疗。目前我国对支原体感染病的检测方法有，金标法、培养法、PCR(聚合酶链式反应) 法，目前国内流行的金标法是用抗原去寻找患者血液中的支原体抗体的方法，该法的优点是操作简便、快速，当天能出检测报告。但是该法有致命的缺陷，其一是不能做早期诊断，因为支原体感染后需要10天左右，患者血液中才能有可检的抗体。其二是检测阳性结果不能确认为当次感染，因为历次感染被治愈后，体内产生的抗体仍然可存留很长时间。培养法是根据支原体的生活特征，采用条件培养基将支原体培养检测出来。该法的优点是操作简便， 准确。其缺点是一般需要M小时才能出结果，给医生及时用药，患者及时治疗带来不便。 PCR法是一种采用多重聚合酶链反应，检出支原体DNA的方法，该法优点是快捷、灵敏，但也存在不足。一是需要较昂贵的设备(PCR仪)，二是需要培养有素的专门人才，否则就容易出现假阴性和假阳性。所以国家卫生部曾颁发了红头文件，禁止用PCR法做一般临床诊断。免疫检测法是采用支原体的单克隆抗体去寻找感染部位分泌物的抗原的方法，该法操作简便快捷，结果准确，整个过程不需要昂贵设备，是一种较理想的检测方法，但是经过专利查新检索，迄今我国未见用支原体单克隆抗体制备的支原体免疫检测试剂的商品和专利报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是采用杂交瘤技术，筛选出能产生特异性强，效价高的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经扩增培养生产出多种支原体单克隆抗体，以一定比例将它们混合，制备成支原体多联免疫检测试剂，能快捷准确检出各种支原体病，为支原体病及时有效治疗提供保证。为达到以上目的，本专利技术是采取如下技术方案予以实现的多种支原体单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括下述步骤(1)将肺炎支原体、人型支原体及溶脲脲原体的三种标准菌株分别扩增培养后，得三种支原体免疫原菌液肺炎支原体原菌液、人型支原体原菌液、溶脲脲原体原菌液；(2)每种原菌液浓度调到105/ml，在50°C 士5°C恒温箱中灭活，并与等量完全佐剂混合，以每只0. 2ml的量，腹腔注射免疫小鼠，于第一次免疫后第7、14、观天分别追加免疫一次；(3)第31天取免疫小鼠脾细胞制成脾细胞悬液，浓度调到IX 108/ml ；再取sp20小鼠骨髓瘤细胞，制成骨髓瘤细胞悬液，浓度调到2 3 X IOVml，将以上两种细胞悬液混合进行细胞融合；(4)然后将经过细胞融合的细胞悬液加到辅有饲养细胞的96孔培养板中，每孔 0. 1ml，将培养板置37°C 士 1°C，含体积浓度5% CO2的孵箱中培养，用酶联免疫反应法检测阳性孔，将确定为阳性的孔的杂交瘤细胞以有限稀释法进行克隆化；(5)用无血清培养液加入到克隆化后的阳性杂交瘤细胞中进行扩增培养，浓度调整为1 X 106/ml，以每只0. 5ml的量腹腔注射接种到Balb/C小鼠，接种后7 14天，处死小鼠，收取腹水、离心、取上清即为该种支原体的腹水型单克隆抗体；(6)采用酶联免疫反应法，分别对肺炎支原体、人型支原体及溶脲脲原体腹水型单克隆抗体进行效价、亚型及交叉试验，筛选出效价为1X10_5 1X10_7、特异性强的肺炎支原体单克隆抗体、人型支原体单克隆抗体和溶脲脲原体单克隆抗体，其中，所述的特异性强是指除自身支原体外不与其它支原体发生交叉反应。上述方法中，步骤C3)所述的细胞融合包括下述步骤①分别吸取含1 X IO8个脾细胞悬液、含2 3X IO7个骨髓瘤细胞悬液，加入离心管中，补加不完全培养液至30ml，充分摇勻；②IOOOrpm离心7分钟，弃去上清；③加入体积浓度为50 %的融合剂PEG溶液0. 7ml ；④加入25ml不完全培养液，使PEG溶液稀释；⑤800rpm离心7分钟，弃去上清；⑥加入20ml的HAT培养液，轻轻吹吸沉淀细胞，使其垂悬并混勻。一种多联免疫检测试剂，其特征在于，将三种支原体单克隆抗体的效价分别调整到1X10_4，以1 1 1的体积比混合，以该混合单克隆抗体为第一抗体制备成多联免疫检测试剂。本专利技术的优点是，所制备出的多联免疫检测试剂可特异性的检出肺炎支原体、人型支原体和溶脲脲原体病。操作简便、结果准确、当天可出结果。整个过程不需抽血，避免给患者带来痛苦；不需昂贵设备，便于推广应用。该多联免疫检测试剂可进行工业化生产，生产和使用过程不产生有害废气废水，不对患者及操作者产生损害，是一种环保、安全、准确、 灵敏的体外诊断生物制品，对其进行产业化开发将产生巨大社会和经济效益。具体实施例方式以下结合具体实施方式对本专利技术作进一步的详细说明。菌种肺炎支原体、人型支原体、溶脲脲原体由美国ATCC公司提供，以上菌株用作免疫原产生单克隆抗体。生殖支原体、穿透支原体也购自美国ATCC公司，主要用作单克隆抗体交叉试验。细胞株sp20小鼠骨髓瘤细胞株由第四军医大学细胞工程研究中心提供，作细胞融合用。制备方法免疫原支原体菌株的制备和灭活将肺炎支原体、人型支原体、溶脲脲原体液体培养基各Iml加到相应的肺炎支原体、人型支原体、溶脲脲原体标准菌株冻干粉中，溶解后， 分别得肺炎支原体、人型支原体、溶脲脲原体的菌液，准备10瓶肺炎支原体液体培养基、10 瓶人型支原体液体培养基、10瓶溶脲脲原体液体培养基，用移液器分别吸取100 μ 1肺炎支原体菌液、100 μ 1人型支原体菌液、100 μ 1溶脲脲原体菌液加到相应的支原体液体培养基中，经培养成阳性反应后，每一种支原体液体培养基将其中的9瓶置_25°C冰箱作种子保存，一瓶用作二级扩增培养，并扩增成10瓶，呈阳性反应后收获，于4°C冰箱保存，以备用作免疫原菌液。Balb/C小鼠的免疫取8周龄的Balb/C小鼠30只，分成3组，每组10只，将每种作免疫原的支原体原菌液的浓度(支原体个数/ml)调到105/ml，置50°C 士5°C恒温箱30分钟灭活，和等量完全佐剂混合后，以每只0. 2ml的量，腹腔注射分别免疫Balb/C小鼠。于第一次免疫后第7、14、 28天分别追加免疫一次，第31天取脾细胞进行细胞融合。细胞融合及培养(1)免疫脾细胞的制备①取免疫小鼠脾脏，放入盛有5ml不完全培养液(不加小牛血清的1640培养液) 的平皿中，置于200目的不锈钢网上。用注射器内芯研磨脾脏，并用平皿内不完全培养液轻轻洗不锈钢网，使脾细胞全部通过网孔挤压到溶液中。②将脾细胞悬液转入50ml离心管中，加不完全培养液到30ml，混勻后，经IOOOrpm离心5分钟，弃去上清。③用不完全培养液将沉淀细胞再离心、洗涤一次(重复步骤②)，将沉淀的细胞垂悬至10ml，混勻，用细胞计数版计数。总细胞数调为1X108。(2) sp20小鼠骨髓瘤细胞悬液的制备①将Sp20小鼠骨髓瘤细胞进行扩增培养。②将4瓶扩增培养的骨髓瘤细胞收集到50ml的离心管内。③IOOOrp本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．多种支原体单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：（１）将肺炎支原体、人型支原体及溶脲脲原体的三种标准菌株分别扩增培养后，得三种支原体免疫原菌液：肺炎支原体原菌液、人型支原体原菌液、溶脲脲原体原菌液；（２）每种原菌液浓度调到１０５／ｍｌ，在５０℃±５℃恒温箱中灭活，并与等量完全佐剂混合，以每只０．２ｍｌ的量，腹腔注射免疫小鼠，于第一次免疫后第７、１４、２８天分别追加免疫一次；（３）第３１天取免疫小鼠脾细胞制成脾细胞悬液，浓度调到１×１０８／ｍｌ；再取ｓｐ２０小鼠骨髓瘤细胞，制成骨髓瘤细胞悬液，浓度调到２～３×１０７／ｍｌ，将以上两种细胞悬液混合进行细胞融合；（４）然后将经过细胞融合的细胞悬液加到辅有饲养细胞的９６孔培养板中，每孔０．１ｍｌ，将培养板置３７℃±１℃，含体积浓度５％ＣＯ２的孵箱中培养，用酶联免疫反应法检测阳性孔，将确定为阳性的孔的杂交瘤细胞以有限稀释法进行克隆化；（５）用无血清培养液加入到克隆化后的阳性杂交瘤细胞中进行扩增培养，浓度调整为１×１０６／ｍｌ，以每只０．５ｍｌ的量腹腔注射接种到Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠，接种后７～１４天，处死小鼠，收取腹水、离心、取上清即为该种支原体的腹水型单克隆抗体；（６）采用酶联免疫反应法，分别对肺炎支原体、人型支原体及溶脲脲原体腹水型单克隆抗体进行效价、亚型及交叉试验，筛选出效价为１×１０－５～１×１０－７、特异性强的肺炎支原体单克隆抗体、人型支原体单克隆抗体和溶脲脲原体单克隆抗体，其中，所述的特异性强是指除自身支原体外不与其它支原体发生交叉反应。...
【技术特征摘要】
1.多种支原体单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括下述步骤(1)将肺炎支原体、人型支原体及溶脲脲原体的三种标准菌株分别扩增培养后，得三种支原体免疫原菌液肺炎支原体原菌液、人型支原体原菌液、溶脲脲原体原菌液；(2)每种原菌液浓度调到105/ml，在50°C士5°C恒温箱中灭活，并与等量完全佐剂混合，以每只0. 2ml的量，腹腔注射免疫小鼠，于第一次免疫后第7、14、观天分别追加免疫一次；(3)第31天取免疫小鼠脾细胞制成脾细胞悬液，浓度调到IXlO8Ail；再取sp20小鼠骨髓瘤细胞，制成骨髓瘤细胞悬液，浓度调到2 3 X IOVml，将以上两种细胞悬液混合进行细胞融合；(4)然后将经过细胞融合的细胞悬液加到辅有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0.Iml, 将培养板置37°C 士 1°C，含体积浓度5% CO2的孵箱中培养，用酶联免疫反应法检测阳性孔， 将确定为阳性的孔的杂交瘤细胞以有限稀释法进行克隆化；(5)用无血清培养液加入到克隆化后的阳性杂交瘤细胞中进行扩增培养，浓度调整为 1 XlOVml,以每只0. 5ml的量腹腔注射接种到Balb/C小鼠，接种后7 14天，处死小鼠， 收取腹水、离心、取上清即为该...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄威权，赵锋，
申请(专利权)人：黄威权，
类型：发明
国别省市：87
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