抗铜绿假单胞菌外膜蛋白单克隆抗体的制备方法技术

本发明专利技术属于医学研究领域，特别公开了一种抗铜绿假单胞菌外膜蛋白单克隆抗体的制备方法。本发明专利技术利用杂交瘤技术制备出了特异性高、敏感度强的新型抗铜绿假单胞菌ＯｐｒＦ蛋白单克隆抗体，为今后通过免疫学方法快速、特异性的检测铜绿假单胞菌感染奠定了实验基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医学研究领域，特别涉及一种抗铜绿假单胞菌外膜蛋白单克隆抗体的 制备方法。
技术介绍
铜绿假单胞菌是一种重要的医源性感染菌，其导致的感染占革兰阴性菌感染的 10%，常继发于肿瘤、大面积创伤、烧伤及使用免疫抑制剂等机体免疫力低下的患者，它的 感染类型多样，可侵害呼吸道、消化道、泌尿系统、骨髓和皮肤等部位。用传统的细菌分离方法鉴定铜绿假单胞菌，耗时长，结果容易受到抗生素治疗和 样本收集不当的影响，方法的敏感性较低；如何使用免疫学的方法快速有效地检测铜绿假 单胞菌感染，目前已被研究人员广泛关注，而用免疫学方法检测铜绿假单胞菌抗原，其基础 是要获得高特异性、高效价的单克隆抗体。
技术实现思路
本专利技术为了弥补现有技术的不足，提供了一种特异性高、敏感性强的抗铜绿假单 胞菌外膜蛋白单克隆抗体的制备方法。本专利技术是通过如下技术方案实现的一种，主要包括如下步骤(1)利用分子生物学方法克隆OprF基因，诱导表达并纯化OprF;(2)用OprF免疫BALB/C小鼠后通过杂交瘤技术制备特异性的mAb (单克隆抗体)， 并用ELISA法(酶联免疫吸附测定法)测定mAb的免疫活性；(3)建立检测铜绿假单胞菌的双mAb夹心ELISA方法，并对其敏感性、特异性进行 初步评价。其中，步骤(1)中，OprF基因通过Ni-NTA-His亲和层析柱纯化。本专利技术的单克隆抗体能特异性结合铜绿假单胞菌，与其它细菌无交叉反应。该抗体与铜绿假单胞菌结合效率高，效价高达1 105。本专利技术利用杂交瘤技术制备出了特异性高、敏感度强的新型抗铜绿假单胞菌OprF蛋白单克隆抗体，为今后通过免疫学方法快速、特异性的检测铜绿假单胞菌感染奠定了实 验基础。附图说明下面结合附图对本专利技术作进一步的说明。附图为本专利技术的操作步骤示意图。具体实施例方式实施例利用所构建的原核表达载体Pet-28b-0prF，诱导表达OprF蛋白；将表达后的蛋白 经超声碎菌后，用Ni-NTA-His亲和层析柱纯化，用纯化后的重组蛋白OprF加入等体积的完 全福氏佐剂进行充分乳化，经腹部和背部皮下注射免疫4只BALB/c小鼠，间隔IOd免疫一 次，共免疫4次；细胞融合、筛选、有限稀释法、克隆化及腹水的制备纯化，均按杂交瘤技术 常规方法进行。分别对所制备的单克隆抗体急性以下几方面的鉴定①单克隆抗体的浓度；②单 克隆抗体的类别和亚类；③单克隆抗体的效价；④单克隆抗体的亲和常数。最后选定两株 单克隆抗体，采用双单克隆抗体夹心ELISA法检测铜绿假单胞菌，进行利用单克隆抗体检 测临床标本中铜绿假单胞菌感染的初步探索。权利要求一种，其特征在于主要包括如下步骤(1)利用分子生物学方法克隆OprF基因，诱导表达并纯化OprF；(2)用OprF免疫BALB/c小鼠后通过杂交瘤技术制备特异性的mAb，并用ELISA法测定mAb的免疫活性；(3)建立检测铜绿假单胞菌的双mAb夹心ELISA方法，并对其敏感性、特异性进行初步评价。2.根据权利要求1所述的，其特征在 于步骤(1)中，OprF基因通过Ni-NTA-His亲和层析柱纯化。全文摘要本专利技术属于医学研究领域，特别公开了一种。本专利技术利用杂交瘤技术制备出了特异性高、敏感度强的新型抗铜绿假单胞菌OprF蛋白单克隆抗体，为今后通过免疫学方法快速、特异性的检测铜绿假单胞菌感染奠定了实验基础。文档编号C07K16/12GK101830982SQ20101018484公开日2010年9月15日 申请日期2010年5月27日 优先权日2010年5月27日专利技术者王燕, 胡成进 申请人:王燕本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗铜绿假单胞菌外膜蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于：主要包括如下步骤：　　（１）利用分子生物学方法克隆ＯｐｒＦ基因，诱导表达并纯化ＯｐｒＦ；　　（２）用ＯｐｒＦ免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠后通过杂交瘤技术制备特异性的ｍＡｂ，并用ＥＬＩＳＡ法测定ｍＡｂ的免疫活性；　　（３）建立检测铜绿假单胞菌的双ｍＡｂ夹心ＥＬＩＳＡ方法，并对其敏感性、特异性进行初步评价。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王燕，胡成进，
申请(专利权)人：王燕，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]