本发明专利技术公开了一种酿酒酵母展示亚油酸异构酶催化合成共轭亚油酸的方法，将含有重组质粒的酿酒酵母K601，接种到YPG培养基中，诱导培养，收集菌体，洗涤，得到酿酒酵母展示亚油酸异构酶催；然后将得到的酿酒酵母展示亚油酸异构酶加入到含有亚油酸的缓冲液中，振荡反应。本发明专利技术将亚油酸异构酶展示表达在酿酒酵母细胞外表面，直接与底物亚油酸接触，提高共轭亚油酸的转化效率，降低生成成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种。
技术介绍
共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid，以下简称CLA)是含有顺式或反式共轭双键的十八碳二烯酸，是必需脂肪酸亚油酸(Linoleic acid，以下简称LA)衍生而成的一组位置和构象异构体的总称。许多微生物能利用自身的亚油酸异构酶将亚油酸转化成共轭亚油酸。但目前应用的亚油酸异构酶主要存在以下问题酶的重组表达方式一般是细胞内表达和分泌表达，细胞内表达时由于酶不能与细胞外底物接触，从而极大地影响酶的催化效率，而且酶分子集聚在细胞内形成反馈抑制，也影响表达效率；分泌表达的主要缺点是表达效率不高，而且也不能实现完全分泌表达，总有相当一部分表达产物滞留于细胞内，从而也不能实现酶与细胞外底物的完全接触。这两种表达方式都导致酶的催化效率不高。
技术实现思路
本专利技术提供一种用，将亚油酸异构酶展示在细胞壁上，可以直接接触到底物，进而提高共轭亚油酸的转化效率。一种，包括将酿酒酵母展示亚油酸异构酶加入到含有亚油酸的缓冲液中，振荡反应；所述的酿酒酵母展示亚油酸异构酶通过如下方法制备将携带重组质粒的酿酒酵母K601，接种到YPG培养基中，诱导培养，离心收集菌体，洗涤，得到酿酒酵母展示亚油酸异构酶；所述的重组质粒包括原始载体pYES2和插入原始载体PYES2的目的基因，所述目的基因由依次连接的Mf α 1信号肽基因、亚油酸异构酶基因、酿酒酵母α-凝集素基因C端锚定区基因组成，所述的Mf α 1信号肽基因插入到原始载体pYES2中GALl启动子的下游。所述的亚油酸异构酶基因Iai来源于植物乳杆菌(LactcAacillusplantarum) 1ρ15-2-1，其保藏号为CGMCC No. 3782，该菌株的分离、纯化及鉴定方法已在中国专利申请 201010251108. X 中公开，GenBank 号为 HQ831447，碱基序列如 SEQ ID NO 1 所示；Mf α 1 酵母信号肽基因来自酿酒酵母，GenBank号为YPL187，碱基序列如SEQ ID NO 3 ；酵母α -凝集素C端锚定区基因sag的GenBank号为YJR004C，碱基序列如SEQ IDNO 2所示。所述的酿酒酵母K601为标准试验菌株，它可以商业购买或从保藏机构获得。所述的缓冲液为磷酸缓冲液。所述的缓冲液中亚油酸的浓度为3mg/ml。所述的振荡反应温度为28 32°C。所述的振荡反应时间为6 80h。本专利技术通过将亚油酸异构酶基因插入到载体pYES2中，导入到酿酒酵母K601中，携带重组质粒的酿酒酵母K601经诱导培养后，亚油酸异构酶通过Mf α 1酵母信号肽分泌到细胞外，并利用亚油酸异构酶下游的凝集素锚定蛋白锚定在酿酒酵母细胞壁上，使亚油酸异构酶展示表达在酿酒酵母细胞外表面，直接与底物亚油酸接触，提高共轭亚油酸的转化效率，降低生成成本。附图说明图1是酵母细胞壁展示表达载体的结构示意图。图2是PCR鉴定酵母转化子的电泳结果图。图3是酵母细胞表面展示亚油酸异构酶酶活测定图。图4酵母细胞表面展示亚油酸异构酶转化合成CLA的气相色谱图；A 阴性对照菌株(转有空载体pYES》转化产物的气相色谱图；B:重组酵母菌菌株转化产物的气相色谱图；C :LA和CLA甲酯标样的气相色谱图，其中1为LA ;2为c9tlI-CLA ；3为tl0cl2_CLA。具体实施例方式实施例1酵母展示重组质粒的构建分别以植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) 1ρ15_2_1和酿酒酵母K601基因组DNA为模板，利用表1中的引物，进行PCR扩增，PCR反应体系为10XPCR buffer(含 Mg2+)5y L，dNTPs(25mM)4y L，引物 1 禾口弓丨物 2 (10 μ Μ)各 1 μ L，基因组 DNA 1 μ g，ExTaqDNA 聚合酶1U，加无菌超纯水至终体积50 μ L ；PCR反应条件为94°C预变性5min ；94°C变性 30s，48°C退火30s (基因mf α 1) /50°C退火40s (亚油酸异构酶基因Iai和酵母α -凝集素 C端含321aa的锚定区基因sag)，72°C延伸lmin，反应30个循环；72°C延伸5min。得到信号肽基因mf al (SEQ ID NO :3)、亚油酸异构酶基因Iai (SEQ ID NO=D和酵母α -凝集素 C端含321氨基酸的锚定区基因sag (SEQ ID NO 2)。表1所用引物序列j丨物引物序列(下划线部分为酶切位点)引物用途及酶切位点MFa 1-5'CGAAGCTTATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGC扩增酵母信号肽 (/Λ>ζ(1ΙΙΙ )MFa 1-3'CGGAATTCAGCTTCAGCCTCTCTTTTATCC扩增酵母信号肽 (EcoR I )SAGl-5，CGCTCGAGAGCGCCAAAAGCTCTTTTATC扩增酵母凝集素基因 sag (Λ7ζο I ) SAG 1-3'CGTCTAGATTAGAATAGCAGGTACGACAAAAGCAG扩增酵母凝集素基因 sag (J a I ) LAI-5，CGGAATTCATGGTTAAAAGTAAAGCAATTATGATTG扩增/α,·基因(￡coRI )LAI-3 ‘ CGCTCGAGGTCAAACATCTTCTTAGTTG_扩增 fa,·基因(Ζ/ζο I )_将PCR产物与克隆载体pMD 18_T simple (pMDS)连接，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，得到质粒pMDS-lai、pMDS-mf a 1和pMDS-sag。首先用HindIII和EcoR I双酶切质粒pMDS-mf α 1和空载体pYES2，回收基因片段mf α 1和载体pYES2并连接，构建 pYES2-mf α 1 (ρYM)载体；再用EcoR I和Xho I双酶切质粒pMDS-lai和ρYM,回收Iai基因片段并将之插入载体PYM中，构建pYES2-mf α 1-lai (pYML)载体；最后用Β ο I和)(baI 双酶切质粒pMDS-sag和pYML，回收基因片段sag和载体pYML并连接，构建酵母展示表达载体pYES2-mf α 1-lai-sag (pYMLS)。结果如图1所示，从N端到C端为GALl启动子 +mf α l+lsii+sEig。实施例2重组酵母的获得及筛选SD(尿嘧啶缺失型)固体筛选培养基(g/L) :SD+2%琼脂粉SD培养基成分(g/L) :16. 8g酵母氮源；0. 77g尿嘧啶缺失型氨基酸；2g半乳糖。载体pYES2上有URA基因，重组酵母菌能够在缺失尿嘧啶的培养基上生长，因此选用SD固体筛选培养基筛选转化子。将上述重组质粒通过电击法转化到酿酒酵母细胞K601中，用Bio-Rad的基因电击转化仪(BTX)，将电击杯转入电击座中，进行电击转化，条件为电压为1.5KV;电容25yF; 电阻200 Ω ；电击时间k ；然后在SD固体筛选培养基上倒置培养，30°C、培养48h，筛选得到转化子；最后对获得的转化子进行亚油酸异构酶基因的PCR扩增鉴定，结果如图2所示，与阴性对照菌株(CK)相比，重组酵母菌菌株均能扩增出约1本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种酿酒酵母展示亚油酸异构酶催化合成共轭亚油酸的方法，包括：将酿酒酵母展示亚油酸异构酶加入到含有亚油酸的ｐＨ６．０－７．０的缓冲液中，振荡反应；所述的酿酒酵母展示亚油酸异构酶通过如下方法制备：将携带重组质粒的酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｋ６０１，接种到ＹＰＧ培养基中，诱导培养，离心收集菌体，洗涤，得到酿酒酵母展示亚油酸异构酶；所述的重组质粒包括原始载体ｐＹＥＳ２和插入原始载体ｐＹＥＳ２的目的基因，所述目的基因由依次连接的Ｍｆα１信号肽基因、亚油酸异构酶基因、酵母α－凝集素Ｃ端锚定区基因组成，所述的Ｍｆα１信号肽基因插入到原始载体ｐＹＥＳ２中ＧＡＬ１启动子的下游。
【技术特征摘要】
1.一种酿酒酵母展示亚油酸异构酶催化合成共轭亚油酸的方法，包括将酿酒酵母展示亚油酸异构酶加入到含有亚油酸的pH6. 0-7. 0的缓冲液中，振荡反应；所述的酿酒酵母展示亚油酸异构酶通过如下方法制备将携带重组质粒的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) K601，接种到YPG培养基中， 诱导培养，离心收集菌体，洗涤，得到酿酒酵母展示亚油酸异构酶；所述的重组质粒包括原始载体PYES2和插入原始载体pYES2的目的基因，所述目的基因由依次连接的Mf α 1信号肽基因、亚油酸异构酶基因、酵母α -凝集素C端锚定区基因组成，所述的Mfa 1信号肽基因插入到原始载体PYES2中GALl启动子的下游。2...
【专利技术属性】
技术研发人员：何国庆，刘佩，阮晖，周倩，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86
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