过氧化氢酶基因及其用途制造技术

本发明专利技术涉及编码过氧化氢酶的基因及其用途，特别是涉及制造亚硫酸盐生成能力强的酿造酵母、使用该酵母制造的酒精饮料及其制造方法等。进一步具体地说，本发明专利技术涉及通过提高酿造酵母的编码过氧化氢酶Cta1p的基因CTA1、特别是啤酒酵母中特征性的non-ScCTA1基因或ScCTA1基因的表达量，使对产品香味稳定性起作用的亚硫酸盐的生成能力提高的酵母及使用该酵母的酒精饮料制造方法等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及编码过氧化氢酶的基因及其用途，特别是涉及制造香味优异的酒精饮料的酿造酵母、使用该酵母制造的酒精饮料及其制造方法等。进一步具体地说，本专利技术涉及通过提高酿造酵母的编码过氧化氢酶Ctalp的基因CTA1、特别是啤酒酵母中特征性的 nonScCTAl基因或&CTA1基因的表达量，使对产品香味稳定化起作用的亚硫酸盐的生成能力提高的酵母及使用该酵母的酒精饮料的制造方法等。
技术介绍
亚硫酸盐作为抗氧化作用强的化合物而为人所知，在食品、饮料、医药品等领域中作为抗氧化剂被广泛应用(例如日本特开平06-040907号公报、日本特开2000-093096号公报等)。在酒精饮料中，亚硫酸盐也被用作抗氧化剂，例如，对需长时间陈酿的葡萄酒的质量保证起重要作用，所以，日本国内厚生劳动省许可添加到残留浓度为350ppm以下。而且，在啤酒酿造产品中，保质期的变化依赖于产品中含有的亚硫酸盐浓度，所以提高此化合物的浓度，在香味稳定性等方面非常重要。使产品中亚硫酸盐含量增大的最简单的方法是添加亚硫酸盐，但此时亚硫酸盐会被作为食品添加剂处理，这会带来商品开发受到限制以及消费者对食品添加剂存在的负面印象等方面的问题。使酿造过程中发酵液中的亚硫酸盐浓度升高的方法，有1)通过过程控制的方法和2)通过酵母育种的方法。通过过程控制的方法，是指由于酿造中亚硫酸盐的生成与初期氧的供给量成反比，所以减少向发酵液中的氧供给量，不仅可增加亚硫酸盐的生成量，同时可抑制其氧化。通过酵母育种的方法利用了基因操作技术。酵母可生物合成自身生命活动所需的含硫化合物，亚硫酸盐则作为生物合成含硫化合物的中间产物而生成。因此，利用酵母的此能力，不由外部添加亚硫酸盐，即可使产品中亚硫酸盐的量增加。MET3及MET14是编码如下还原酶的基因，其为参与从培养基中摄入的硫酸根离子生物合成亚硫酸盐过程的还原酶。C. Korch等进行了以下尝试，通过使此2个基因的表达量增加提高酵母的亚硫酸盐生成能力，并证明 MET14 更为有效(C. Korch et al.，Proc. Eur. Brew. Conv. Conger.， Lisbon，201-208，1991)。另外，J. Hansen等进行了以下尝试，通过破坏编码亚硫酸盐还原酶 (sulfite ion reductase)的METlO基因，防止生成的亚硫酸盐还原，而使亚硫酸盐生成量增加(J.Hansen et al.，Nature Biotech.，1587-1591，1996)，但同时也出现了发酵延迟， 以及不受欢迎的香味成分乙醛及1-丙醇的增加的问题。而且，藤村等进行了以下尝试，通过提高编码酵母的亚硫酸根离子排出泵的SSUl 基因中啤酒酵母中特有的nonScSSUl基因的表达量，促进菌体内生成的亚硫酸盐向菌体外排出，以增加啤酒中的亚硫酸盐浓度(藤村等，2003年度日本农艺化学会年次大会要旨集， 159，2003。日语原名；藤村^、2003年度日本農芸化学会年次大会要旨集、159、2003)。
技术实现思路
如上所述，使产品中亚硫酸盐含量增大的最简单的方法是添加亚硫酸盐，但近年来，消费者中对无添加、天然原料的愿望增强，并希望食品添加剂的使用为最低限。因此，利用酵母自身的生命活动，对不由外界添加亚硫酸盐即可达到对香味稳定性有效的亚硫酸盐浓度是行之有效的。但是，上述通过过程控制的方法由于供氧不足有时会降低酵母的增殖速度，引起发酵延迟及品质下降，所以不一定实用。另外，有文献报道利用基因操作技术进行酵母育种，其结果达到了亲株的10倍以上的亚硫酸盐浓度(J.Hansen et al.，Nature Biotech.，1587-1591，1996)，但另一方面， 也出现了发酵延迟，以及不受欢迎的香味成分乙醛及1-丙醇的增加等问题，所以实际应用的酵母还存在着问题。因此，希望能有既不影响发酵速度和产品质量，又能生产足量亚硫酸盐的酵母的育种方法。本专利技术者为解决上述课题不断锐意研究的结果，从啤酒酵母中成功地鉴定、分离了编码过氧化氢酶的基因。且制备了将所得基因导入酵母并使其表达的转化酵母，确认了亚硫酸盐生成量的增加，从而完成了本专利技术。本专利技术涉及啤酒酵母中存在的过氧化氢酶基因、该基因编码的蛋白质、该基因的表达得到调节的转化酵母、通过使用基因表达得到调节的酵母而控制产品中亚硫酸盐生成量的方法等。具体地说，本专利技术提供如下所示的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、导入了该载体的转化酵母、使用该转化酵母的酒精饮料的制造方法等。(1)从以下(a) (f)组成的群组中选择的多核苷酸(a)含有由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸的多核苷酸；(b)含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；(c)含有编码由序列号2的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或增加了 1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的、且具有过氧化氢酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；(d)含有编码具有与序列号2氨基酸序列有60%以上同一性的氨基酸序列、且具有过氧化氢酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；(e)含有与序列号1碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交，且编码具有过氧化氢酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸以及(f)含有与由编码序列号2氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码具有过氧化氢酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。(2)上述⑴中所述的多核苷酸，其从以下(g) ⑴组成的群中选择(g)含有编码由序列号2的氨基酸序列或序列号2氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或增加了 1 10个氨基酸的氨基酸序列组成的、且具有过氧化氢酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；(h)含有编码具有与序列号2氨基酸序列有90%或90%以上同一性的氨基酸序列、且具有过氧化氢酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；以及(i)含有与由序列号1碱基序列组成的多核苷酸或序列号1碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交、且编码具有过氧化氢酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸。(3)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸。(4)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。(5)上述(1) (4)中任一项所述的多核苷酸，其是DNA。(6)蛋白质，其由上述(1) (5)中任一项所述的多核苷酸编码。(7)载体，其含有上述⑴ (5)中任一项所述的多核苷酸。(7a)上述(7)中所述的载体，其含有具有以下(χ) (ζ)组成要素的表达盒(χ)在酵母细胞内可转录的启动子；(y)上述⑴ (5)中任一项所述的多核苷酸，其与该启动子以正义方向或反义方向结合；以及(ζ)与RNA分子的转录终止及多聚腺苷酸化有关的、在酵母中起作用的信号。(8)载体，其含有从以下(j) ⑴组成的群中组选择的多核苷酸(j)含有编码由序列号4的氨基酸序列或序列号4氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或增加了 1 10个氨基酸的氨基酸序列组成的、且具有过氧化氢酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸；(k)含有编码具有与序列号4氨基酸序列有90%或90%以上同一性的氨基酸序列、且具有过氧化氢酶活性的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．从以下组中选择的多核苷酸：（ａ）由序列号：３的碱基序列组成的多核苷酸；和（ｂ）编码由序列号：４的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。

【技术特征摘要】
2006.02.28 JP 2006-0539511.从以下组中选择的多核苷酸(a)由序列号3的碱基序列组成的多核苷酸；和(b)编码由序列号4的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。2.权利要求1所述的多核苷酸，其是DNA。3.蛋白质，其由权利要求1或2所述的多核苷酸编码。4.载体，其含有权利要求1或2所述的多核苷酸。5.酵母，其中导入了权利要求4中所述的载体。6.权利要求5所述的酵母，其亚硫酸盐的生成能力增强了。7.权利要求6所述的酵母，其亚硫酸盐生成能力的增强是通过使权利要求3中所述的蛋白质的表达量增加而获得。8.酒精饮料的制造方法，其包括培养权利要求5 7中任一项所述的酵母。9.权利要求8所述的酒精饮料的制造方法，其中所酿造的酒精饮料是麦芽饮料。10.权利要求8所述的酒精饮料的制造方法，其中所酿造的酒精饮料是葡萄酒。11.一种评价被检酵母的亚硫酸盐生成能力的方法，其包括使用由序列号3...

【专利技术属性】
技术研发人员：中尾嘉宏，儿玉由纪子，下永朋子，大村文彦，
申请(专利权)人：三得利控股株式会社，
类型：发明
国别省市：JP