本发明专利技术公开了一种产3-羟基丙酸均聚物和/或3-羟基丙酸共聚物的重组菌及其应用。本发明专利技术提供的重组菌的一种构建方法，包括如下步骤：将1，3-丙二醇脱氢酶编码基因、醛脱氢酶编码基因、3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因和PHA聚合酶编码基因导入出发菌，得到重组菌。本发明专利技术的实验证明：该工程菌可高效表达3-羟基丙酸辅酶A连接酶及PHA聚合酶基因，使3-羟基丙酸经过3-羟基丙酰辅酶A最终被聚合为3-羟基丙酸均聚物(P(3HP))。小型发酵罐实验表明将本发明专利技术的工程菌在6L发酵罐中发酵后，P(3HP)的产量最高可达8.9g/L以上，P(3HP)最高可达细胞干重的91.5％。且本发明专利技术的生产工艺简单，成本低廉，应用前景广阔。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基因工程菌，尤其涉及一种产3-羟基丙酸均聚物和/或3-羟基丙酸共聚物的重组菌及其应用。
技术介绍
聚羟基烷酸(Polyhydroxyalkanoates，PHAs)是由许多微生物在不平衡生长条件下在胞内积累的，具有热可塑性、生物相容性、光学活性和压电特性等优良性能的一类聚合物，在自然界中可被微生物完全降解生成水和二氧化碳。它完全有可能取代日益严重污染环境的化学塑料，在医学、药学、精细化学等方面也极具有应用价值。其结构式如式I所示：根据单体的种类，PHA分为同聚物(均聚物，homopolymer)和共聚物(copolymer)两类：前者只有一种单体；后者含有两种或两种以上的单体。聚3-羟基丙酸是一种新型生物可降解高分子聚合物，它具有良好的生物降解性和生物相容性，而且高分子量的P(3HP)具有很高的机械强度和拉伸强度(＞400MPa)，以及具有较大的断裂伸长率等优异性能。目前其合成主要采用生物发酵或者两步法开环聚合得到。相对于纯化学合成方法如开环聚合途径来合成有机物，生物合成方法具有经济消耗低，污染少，反应条件宽松(37℃和标准大气压)等优点。但由于3HP的特殊结构，至今国际上关于P(3HP)的合成研究报道仍然较少。目前，已有研究用微生物法以甘油为底物合成P(3HP)，该途径克隆了甘油脱水酶基因(dhaBlCb)，丙醛脱氢酶(pduPSe)基因及PHA聚合酶基因(phaClCn)。此为首例采用微生物方法以甘油为前体合成均聚P(3HP)的报道，最终积累的P(3HP)仅占细胞干重的12％，且需要二步培养法，生产工艺较为复杂。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供重组菌的一种构建方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：将1，3-丙二醇脱氢酶编码基因、醛脱氢酶编码基因、3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因和PHA聚合酶编码基因导入出发菌，得到重组菌。所述1，3-丙二醇脱氢酶的氨基酸序列为序列表中序列10；所述醛脱氢酶的氨基酸序列为序列表中序列11；所述3-羟基丙酸辅酶A连接酶的氨基酸序列为序列表中序列12；所述PHA聚合酶的氨基酸序列为序列表中序列13。-->所述1，3-丙二醇脱氢酶基因的核苷酸序列为序列表中序列1；所述醛脱氢酶基因的核苷酸序列为序列表中序列2；所述3-羟基丙酸辅酶A连接酶基因的核苷酸序列为序列表中序列3；所述PHA聚合酶基因的核苷酸序列为序列表中序列4；所述出发菌为大肠杆菌，具体为Escherichia coli Trans5α、Escherichia coli Trans1-T1或Escherichia coli S17-1。但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)。所述1，3-丙二醇脱氢酶编码基因和所述醛脱氢酶编码基因通过重组载体A导入所述出发菌中；所述3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因和所述PHA聚合酶编码基因通过重组载体B导入所述出发菌中；所述重组载体A为将启动子PRe插入pZL-dhaT-aldD的ApaI和Xhol识别位点间得到的载体；所述重组载体B为将3-羟基丙酸辅酶A的编码基因插入到pBHR68的StuI和EcoRI识别位点间得到的载体。所述启动子PRe的核苷酸序列为序列表中的序列5。由所述的方法构建的重组菌。本专利技术的另一个目的是提供一种生产3-羟基丙酸均聚物和/或3-羟基丙酸共聚物的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：发酵所述的重组菌，收集发酵产物，即得到3-羟基丙酸均聚物和/或3-羟基丙酸共聚物。所述发酵温度为30℃-40℃；所述发酵的溶氧量为10％-30％(体积百分含量)；所述发酵培养基的pH为6-8；所述发酵温度具体为30℃、37℃或40℃；所述发酵的溶氧量具体为10％、20％或30％(体积百分含量)；所述发酵培养基的pH具体为6、7或8。所述发酵过程中，在所述重组菌进入稳定期起至发酵结束，向所述发酵培养基中分批补加1，3-丙二醇和/或1，4-丁二醇，使每L发酵产物中的1，3-丙二醇或1，4-丁二醇含量均不高于30g。所述分批发酵为当细菌生长进入稳定期，加入1，3-丙二醇3瓶(共含30g 1，3-丙二醇，溶于15ml水)。此后，每间隔4h取样，当1，3-丙二醇浓度低于5g/L时，补加1，3-丙二醇10g。也可采用流加的方式，将1，3-丙二醇溶液加入发酵液中，采用流加方法时，流加速度按照每L培养基1～10mL/h(丙二醇溶液配置方法如上所述)。所述每L发酵产物中的1，3-丙二醇或1，4-丁二醇含量均为1g/L-30g/L，所述每L发酵产物中的1，3-丙二醇或1，4-丁二醇含量均具体为1g/L-10g/L、10g/L-20g/L或20-30g/L；所述发酵时间为32h-50h，所述发酵时间具体为32h、44h或50h；所述3-羟基丙酸共聚物为3-羟基丙酸和4-羟基丁酸共聚物。可采用生物工程领域中常用的方法将含有1，3-丙二醇脱氢酶、醛脱氢酶、3-羟基丙酸辅酶A连接酶及PHA聚合酶基因的表达载体转化假单胞菌宿主菌，如接合转化法、电击-->转化法、氯化锂转化法或原生质体转化法等，优选为接合转化法。可采用大肠杆菌的常规培养条件对重组大肠杆菌进行培养。在发酵罐发酵中，可采用如下的LB培养基进行发酵：罐底成分：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，其余为水；也可采用适用与本专利技术工程菌的改良LB培养基(LB’)配方：10g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，其余为水。本专利技术中，还可使用TB培养基进行发酵，罐底成分：24g/L酵母提取物，12g/L蛋白胨，4ml/L甘油，0.017mol/L KH2PO4，0.072mol/L K2HPO4。(溶液先在15psi高压下蒸汽灭菌20min，当冷至60℃或60℃以下时加入无菌的KH2PO4水溶液，K2HPO4水溶液)。在实际培养过程中，可向上述培养基中再添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如50μg/mL氨苄青霉素和硫酸卡那霉素。本专利技术的第三个目的是提供一种生产3-羟基丙酸均聚物和/或3-羟基丙酸共聚物的载体组合物。本专利技术提供的组合物，由所述的方法中的重组载体A和重组载体B组成；所述3-羟基丙酸共聚物为3-羟基丙酸和4-羟基丁酸共聚物。本专利技术的实验证明，本专利技术提供了一种含有1，3-丙二醇脱氢酶基因，醛脱氢酶基因，3-羟基丙酸辅酶A连接酶及PHA聚合酶的专用表达工程菌，该工程菌可高效表达1，3-丙二醇脱氢酶及醛脱氢酶基因，在脱氢酶的作用下转化底物1，3-丙二醇为3-羟基丙酸，转化效率较高。同时，该工程菌也高效表达3-羟基丙酸辅酶A连接酶及PHA聚合酶基因，使3-羟基丙酸经过3-羟基丙酰辅酶A最终被聚合为3-羟基丙酸均聚物(P(3HP))。小型发酵罐实验表明将本专利技术的工程菌在6L发酵罐中发酵后，P(3HP)的产量最高可达8.9g/L以上，P(3HP)最高可达细胞干重的91.5％。且本专利技术的生产工艺简单，成本低廉，应用前景广阔。附图说明图1为1，3-丙二醇、3-羟基丙酸、3-羟基丙酸均聚物和3-羟基丙酸共聚物的转化关系示意图图2为质粒pZQ01和pZQ03的结果示意图图3为1H核磁共振NMR检测细胞中均聚物具体实施方式下本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．重组菌的一种构建方法，包括如下步骤：将１，３－丙二醇脱氢酶编码基因、醛脱氢酶编码基因、３－羟基丙酸辅酶Ａ连接酶编码基因和ＰＨＡ聚合酶编码基因导入出发菌，得到重组菌。
【技术特征摘要】
1.重组菌的一种构建方法，包括如下步骤：将1，3-丙二醇脱氢酶编码基因、醛脱氢酶编码基因、3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因和PHA聚合酶编码基因导入出发菌，得到重组菌。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述1，3-丙二醇脱氢酶的氨基酸序列为序列表中序列10；所述醛脱氢酶的氨基酸序列为序列表中序列11；所述3-羟基丙酸辅酶A连接酶的氨基酸序列为序列表中序列12；所述PHA聚合酶的氨基酸序列为序列表中序列13。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述1，3-丙二醇脱氢酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1；所述醛脱氢酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2；所述3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列3；所述PHA聚合酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4；所述出发菌为大肠杆菌，具体为Escherichia coli Trans5α、Escherichia coliTrans1-T1或Escherichia coli S17-1。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述1，3-丙二醇脱氢酶编码基因和所述醛脱氢酶编码基因通过重组载体A导入所述出发菌中；所述3-羟基丙酸辅酶A连接酶编码基因和所述PHA聚合酶编码基因通过重组载体B导入所述出发菌中；所述重组载体A为将启动子PRe插入pZL-dhaT-aldD的多克隆识别位点得到的载体；所述重组载体B为将3-羟基丙酸辅酶A的编码基因插入到pBHR68的多克隆识别位点得到的载体。5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈国强，周琴，石振宇，孟德川，吴琼，陈金春，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11
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