改变植物形态学、生物化学和生理学的方法技术

本发明专利技术涉及刺激根生长和/或增强侧根或不定根形成和/或改变根的向地性的方法，其包在植物或植物部分中含表达植物细胞分裂素氧化酶或者表达可降低活性细胞分裂素水平的另一种蛋白质。本发明专利技术也涉及新的植物细胞分裂素氧化酶蛋白质、编码细胞分裂素氧化酶蛋白质的核酸序列、以及包含该序列的载体、宿主细胞、转基因细胞和植物。本发明专利技术还涉及所述序列在改善与根有关的特性(包括提高产量和/或增强早期活力和/或改变根/枝条比率和/或提高抗倒伏和/或增强耐旱和/或促进外植体的体外繁殖和/或改变细胞命运和/或植物发育和/或植物形态学和/或植物生物化学和/或植物生理学)上的用途。本发明专利技术还涉及所述序列在上述方法中的用途。本发明专利技术还涉及鉴定和获得与细胞分裂素氧化酶蛋白质相互作用的蛋白质和化合物的方法。本发明专利技术还涉及所述化合物作为植物生长调节剂或除草剂的用途。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术一般涉及改变植物形态学、生物化学和生理学性质或特征的方法，例如一种或多种发育过程和/或环境适应过程，包括而不限于改变起始或刺激或增强根的生长、 和/或不定根形成、和/或侧根形成、和/或根的向地性、和/或枝条生长、和/或顶端优势、 和/或分枝、和/或衰老时间、和/或开花时间、和/或花朵形成、和/或种子发育、和/或种子产量，所述方法包含在植物中，在可调节的启动子序列(例如细胞特异性启动子、组织特异性启动子或器官特异性启动子序列)控制之下表达细胞分裂素降解控制蛋白质，特别是细胞分裂素氧化酶。本专利技术所改变的特征优选为细胞分裂素介导和/或生长素介导的特征。本专利技术延伸到用于施行本专利技术方法的遗传构建体，以及随之产生的转基因植物，与同基因相应物相比，该植物具有改变的形态学和/或生物化学和/或生理学性质。
技术介绍
根是高等植物的重要器官。其主要功能是将植物固定在土壤中，并摄取水分和养分(N-营养、矿物质等)。因此，根的生长对地面上器官的生长和产量具有直接或间接的影响，特别是在养分受限的条件下。根也与产生植物次生产物有关，例如防御化合物和植物激ο在许多重要作物中，根也是储存器官。在欧洲，糖用甜菜是最重要的产糖植物O 亿6千万吨/年；占世界产量的38%)。树薯(木薯)、薯蓣和甘薯(batate)是重要的淀粉生产者(每种大约1亿5千万吨/年)。其淀粉含量可高达马铃薯的两倍。在许多植物(例如胡萝卜、萝卜)、草本植物(例如姜、kukuma)和药用植物(例如人参)中，根也是用于消耗的器官。此外，在根中发现的一些次生植物产物具有化学和制药工业的经济价值。例如薯蓣，其包含用于合成类固醇激素的基本分子。另一个例子是紫草素，由紫草(Lithospermum erythrorhizon)发根培养的根制备。紫草素用于抗炎症、抗肿瘤以及伤口愈合特性。此外，改善作物根的生长还会增强与杂草植物的竞争性，并提高水的可及性和摄取而改善在干旱地区的生长。改善根的生长也与生态目的有关，例如生物除污以及预防/阻止土壤侵蚀。根的构造是尚有大量利用传统繁殖未探索过的领域，因为难以在田间评价这种性状。由于生物技术不依赖于大规模的田间筛选，因而可对改善该性状具有重要影响。生物技术方法还需要对决定植物具体特征的分子元件的基本了解。如今，这些知识还只是零碎的，因此生物技术至今不能实现在此领域的突破。完善确定的的根生长的调节剂是植物生长素。对生长的植物施加吲哚-3-乙酸 (IAA)可促进侧根发育及侧根伸长(Torrey，Am J Bot 37 =257-264,1950 ；Blakely 等人， Bot Gaz 143 :341-352，1982 ;Muday 禾口 Haworth， Plant Physiol Biochem 32:193—203， 1994)。处于IAA浓度范围下的根开始增加许多侧根(Kerk等人，Plant Physiol, 122 7925-932，2000)。此外，响应特定浓度的外源植物生长素而生成侧根的根随后置于较高浓度的IAA中，在现有的根之间形成许多额外的侧根(Kerk等人，Plant Physiol, 122 :925-932, 2000)。相反，在包含植物生长素转运抑制剂(包括NPA)的琼脂上生长的根的侧根数目下降(Muday 和 Haworth，Plant Physiol Biochem 32:193-203,1994)。已经分离了包含内源性IAA水平升高的鼠耳芥属(Arabidopsis)突变体(Boerjan 等人，Plant Cell 7 :1405_141，1995 ;Celenza等人，Gene Dev 9 :2131_2142，1995 ;King等 A, Plant Cell 7 :2023_2037，1995 ;Lehman 等人，Cell 85:183-194,1996)。目前已知它们是位于染色体2上单座位的等位基因。这些突变体的幼苗具有过量的不定根和侧根，与上述施加外源植物生长素的效果相一致。植物生长素对形成不定根和侧根的刺激效应提示在转基因植物中过量产生植物生长素是促进生根的有效策略。然而，这样是否会产生具有改善特性的商用产品尚有疑问。 除了对形成不定根和侧根的刺激效应以外，植物生长素的过量生成引发其它效应，例如叶子数目减少、叶子形态异常(狭窄、卷曲的叶子)、花序发育不全、顶端优势增强、茎上形成不定根，从农学观点来看，其中大部分不合需要(Klee等人，Genes Devel 1 =86-96,1987 ； Kares等人，Plant Mol Biol 15 :225_236，1990)。因此，有赖提高植物生长素合成的方法的主要问题在于容留问题，即将植物生长素的效应局限于根。不可能利用组织特异性启动子克服这种容留问题植物生长素在植物中转运，因而其作用不局限于合成位点。另一问题在于，植物生长素是否总是提高根的总生物量。对于琼脂中生长的植物，已经注意到逐步提高浓度刺激侧根形成，但同时抑制这些根的长出(Kerk等人，Plant Physiol, 122 =925-932, 2000)。通过本专利权利要求的实施方案，可解决上述有关容留植物生长素效应以及维持根的长出的问题。专利技术概述本专利技术涉及遗传构建体，其包含编码鼠耳芥(Arbidopsis thaliana)的具有细胞分裂素氧化酶活性的蛋白质的基因。该基因在调节启动子的控制下表达。该启动子可由内源性组织特异性或环境特异性因子调节，或者另外地，可应用特定的化学制剂进行诱导。本专利技术还涉及包含该遗传构建体的细胞或者植物。本专利技术还涉及在根或根的某些组织或细胞类型特异性的启动子控制下表达细胞分裂素氧化酶基因来改变根的构造以及生物量的方法。专利技术详述为了绕过上述关于提高植物生长素生物合成的问题，决定遵循另一方法。我们推论，与提高植物生长素水平相比，下调植物生长素的生物拮抗剂可能对根的生长引起类似以至更大的影响。激素的作用以及相互作用极其复杂，但我们假定细胞分裂素能够对根的生长起到植物生长素拮抗剂的作用。植物组织培养的激素研究已经显示，植物生长素与细胞分裂素的比值比其中每种激素的绝对水平对于器官发生更为重要，这实际上表明这些激素起拮抗剂作用，至少在某些生物进程中如此。此外，外源施用细胞分裂素抑制侧根形成。 有趣的是，细胞分裂素处理对根的伸长还有负面影响，这提示细胞分裂素控制根的分支以及根的长出。总之，目前的文献资料表明，提高细胞分裂素的水平负面影响根的生长，但对该过程的机制并不了解。植物中细胞分裂素合成的位置处于根尖以及枝条的幼稚组织。细胞分裂素的内生浓度在nM范围内。然而，由于难于量化，需要提取的相当大的组织数量，以及并不知道实际的局部浓度。也不知道细胞分裂素的亚细胞区域化。一般认为自由的碱基和核糖核苷定位于细胞质和细胞核，而糖苷定位于液泡。还存在化学结构略微差异的不同细胞分裂素。因此，不知道外源细胞分裂素的效应是否应归于细胞分裂素的总浓度的提高，还是更应归于其它形式的植物产生的细胞分裂素(结构、细胞或亚细胞定位不同)竞争受体、转位分子、运输器、修饰酶......为了检验根中细胞分裂素水平实际上超出最适于根生长水平的假设，从鼠耳芥中克隆了编码细胞分裂素氧化酶(本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．编码植物细胞分裂素氧化酶或者编码可降低活性细胞分裂素水平的蛋白质的核酸的用途，用于植物或植物部分中刺激根的生长或增强侧根或不定根形成或改变根的向地性。

【技术特征摘要】
2000.06.16 EP 00870132.8;2001.03.16 EP 01870053.4;1.编码植物细胞分裂素氧化酶或者编码可降低活性细胞分裂素水平的蛋白质的核酸的用途，用于植物或植物部分中刺激根的生长或增强侧根或不定根形成或改变根的向地性。2.刺激根生长或增强侧根和不定根形成或改变根的向地性的方法，其包含表达编码植物细胞分裂素氧化酶的核酸，选自(a)包含由任何SEQID NO 27、1、3、5、7、9、11、25、26、沘至31、33或；34，或其互补序列所示的DNA序列的核酸，(b)包含相应于任何SEQID NO 27、1、3、5、7、9、11、25、26、沘至31、33或；34，或其互补序列的RNA序列的核酸，(c)与任何SEQID NO 27、1、3、5、7、9、11、25、洸、沘至31、33或34，或其互补序列特异性杂交的核酸，(d)编码包含任何SEQID NO 2、4、6、8、10、12、32或35，或其互补序列所示的氨基酸序列的蛋白质的核酸，(e)任何(a)-(d)定义的核酸，其特征在于所述核酸是DNA、基因组DNA、cDNA、合成DNA 或其中T替换为U的RNA，(f)通过遗传密码可简并为任何SEQID NO 27、1、3、5、7、9、11、25、洸、28-31、33或34 中所示的核酸的核酸或者简并为任何(a)-(e)中定义的核酸的核酸，(g)由于生物之间密码子使用的差异不同于编码任何SEQID N02、4、6、8、10、12、32或 35中所示的蛋白质的核酸的核酸，或者不同于任何(a)-(e)中定义的核酸的核酸，(h)编码SEQID NO 2、4、6、8、10、12或35中所示的蛋白质的核酸，或者(a)-(e)中定义的核酸，其由于等位基因之间的差异而不同，(i)编码任何SEQID NO 2、4、6、8、10、12或35中所示的蛋白质的核酸，(j)任何(a)-(i)中定义的核酸的、具有细胞分裂素氧化酶生物活性的功能性片段，以及(k)编码植物细胞分裂素氧化酶的核酸，或者包含在植物或植物部分中、优选在根中表达编码可降低活性细胞分裂素水平的蛋白质的核酸。3.编码具有细胞分裂素氧化酶活性的新植物蛋白质的分离的核酸，选自(a)包含任何SEQID NO四、3、5、9、26、27、31、33或；34，或其互补序列所示的DNA序列的核酸，(b)包含相应于任何SEQID NO四、3、5、9、26、27、31、33或；34，或其互补序列的RNA序列的核酸，(c)与任何SEQID NO四、3、5、9、26、27、31、33或34，或其互补序列所示的核酸特异性杂交的核酸，(d)编码具有包含SEQID NO 32所示的多肽的氨基酸序列、并且与SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列至少70%相似性的蛋白质的核酸，(e)编码具有与SEQID NO 6所示的氨基酸序列至少47%相似性的氨基酸序列的蛋白质的核酸，(f)编号具有与SEQID NO 10或35所示的氨基酸序列至少47%相似性的氨基酸序列的蛋白质的核酸，(g)编码包含任何SEQID NO 4、6、10、32或35中所示的氨基酸序列的蛋白质的核酸，(h)通过遗传密码可简并为任何SEQID NO 29、3、5、9、沈、27、33或34中所示核酸的核酸或者简并为任何(a)-(g)中定义的核酸的核酸，(i)由于生物之间密码子使用的差异而不同于编码任何SEQID NO 4、6、10或35中所示蛋白质的核酸的核酸，或者不同于任何(a)-(g)中定义的核酸的核酸，(j)编码SEQ ID NO 4、6、10或35中所示蛋白质的核酸，或者(a)-(g)中定义的核酸， 其由于等位基因之间的差异而不同，(k)编码任何SEQ ID NO四、3、5、9、26、27、31、33或34中所示核酸编码的细胞分裂素氧化酶的免疫活性片段的核酸，或者编码任何(a)-(j)中定义的核酸的免疫活性片段的核酸，(1)编码任何SEQ ID NO四、3、5、9、26、27、31、33或34中所示核酸编码的细胞分裂素氧化酶的功能性片段的核酸，或者编码任何(a)-(j)中定义的核酸的功能性片段的核酸， 其中所述片段具有细胞分裂素氧化酶的生物活性，以及(m)编码SEQ ID NO 4、6、10或35中定义的蛋白质的核酸，只要所述核酸不是按下列Genbank登录号保存的核酸AC005917、AB024035和 AC023754o4.权利要求3的分离的核酸，它们是DNA、cDNA、基因组DNA或合成的DNA、或其中T替换为U的RNA。5.至少15个核苷酸长度的核酸分子，其与权利要求3或4的核酸特异性杂交。6.至少15个核苷酸长度的核酸分子，其特异性扩增权利要求3或4的核酸。7.包含权利要求3或4的核酸的载体。8.权利要求7的载体，其为表达载体，其中该核酸与使所述核酸在原核和/或真核宿主细胞中表达的一个或多个控制序列有效连接。9.包含根据权利要求3或4的核酸或者权利要求7或8的载体的宿主细胞。10.权利要求9的宿主细胞，其中该宿主细胞是细菌、昆虫、真菌、植物或动物细胞。11.权利要求3或4的核酸编码的分离的多肽，或其同系物或衍生物或其免疫活性或功能性片段。12.权利要求11的多肽，其具有任何SEQID NO 2、4、6、8、10、12、32和35、或其同系物或衍生物、或其免疫活性和/或功能性片段所示氨基酸序列。13.产生权利要求11或12的多肽的方法，其包含在使该多肽表达的条件下培养权利要求9或10的宿主细胞，并从培养物中回收生成的多肽。14.特异性识别权利要求11或12的多肽或其特异性表位的抗体。15.产生转基因植物、植物细胞或植物组织的方法，其包含在所述植物、植物细胞或植物组织中引入可表达形式的权利要求3或4的核酸或者权利要求7或8的载体。16.产生改变的植物、植物细胞或植物组织的方法，其包含将权利要求11或12的多肽直接引入所述植物的细胞、组织或器官中。17.实现权利要求11或12的多肽表达的方法，其包含在植物细胞的基因组中稳定引入与一个或多个控制序列有效连接的权利要求3或4的核酸或者权利要求7或8的载体。18.权利要求16或17的方法，其另外包含由所述植物细胞再生为植物。19.包含权力要求3或4的核酸的转基因植物细胞，该核酸与允许其在植物细胞中转录和/或表达的调控元件有效联接，或者利用权力要...

【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯·施穆林，托马斯·维尔纳，
申请(专利权)人：托马斯·施穆林，托马斯·维尔纳，
类型：发明
国别省市：DE