一种二氢鞘氨醇羟化酶基因及编码的多肽制造技术

本发明专利技术公开一种二氢鞘氨醇羟化酶基因及编码的多肽。所述的二氢鞘氨醇羟化酶基因片段的碱基序列，全长为438bp，其氨基酸序列中101个氨基酸组成的蛋白质。本发明专利技术克隆分离了一种在酵母中可催化二氢鞘氨醇在C4位羟基化生成植物鞘氨醇的二氢鞘氨醇羟化酶基因的核苷酸序列，并提供了其编码的蛋白质的氨基酸序列，以应用于麻黄碱代谢途径基因在异常汉逊酵母中整合后，由于代谢途径重构造成异常汉逊酵母基因表达谱发生变化的研究，并为二氢鞘氨醇羟化酶基因的相关研究提供新的基因序列信息。扩大了二氢鞘氨醇羟化酶基因的资源，同时为转基因重组酵母生物合成麻黄碱的代谢途径研究和利用该基因构建基因工程菌提供了依据，具有广泛的应用领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物次生物质代谢
具体的说，本专利技术涉及一种涉及产麻黄碱的转基因重组异常汉逊酵母二氢鞘氨醇羟化酶基因的克隆及编码的多肽

技术介绍
麻黄碱(Ι-ephedrine)和伪麻黄碱(d-pseudo-印hedrine)是麻黄植物中生物碱类次生代谢产物，具有重要的药用价值。麻黄碱和伪麻黄碱的生物合成由多基因控制，其代谢途径的相关基因没有任何相关信息，因此长久以来麻黄碱工业化生产主要依靠从天然植物麻黄中直接提取与化学合成两种方法。二氢鞘氨醇羟化酶(sphingosine hydroxylase，简称SUM)是真核生物中可将二氢鞘氨醇C4位羟基化催化产生植物鞘氨醇的酶。鞘氨醇作为真核细胞内的脂类信号分子， 参与细胞内多种生理过程的信号传导过程；参与脂质代谢途径与真核生物细胞膜的合成相关，有维持细胞膜完整性的作用，并参与氨基酸的转运和作为细胞膜上蛋白质的锚定位点等作用。目前二氢鞘氨醇羟化酶仅用于真核生物细胞膜合成以及细胞内信号物质传导的研究。随着生物技术和酶工业的发展，为获得重组酵母菌合成麻黄碱时高表达二氢鞘氨醇羟化酶基因片段打好技术基础。
技术实现思路
鉴于采用SSH技术分离获得多条重组酵母菌合成麻黄碱时差异表达基因片段，其中高表达的二氢鞘氨醇羟化酶基因片段参与酵母麻黄碱生物合成代谢途径的调控。因此， 本专利技术旨在提供一种在产麻黄碱的转基因重组异常汉逊酵母中高表达的二氢鞘氨醇羟化酶基因片段序列和编码多肽序列，以应用于麻黄碱次生代谢途径的研究，为麻黄碱代谢途径基因在异常汉逊酵母中的整合、表达以及调控研究奠定基础，也为二氢鞘氨醇羟化酶基因片段的相关研究领域提供新的基因资源。本专利技术的技术方案通过利用产麻黄碱的转基因重组酵母是新疆大学利用离子束介导野生蓝麻黄基因组DNA在异常汉逊酵母中的随机转化获得重组酵母菌，相关方法和重组菌种已获国家专利技术专利授权(专利号ZL 200610011402.7)。以出发菌株异常汉逊酵母2. 340和重组酵母CGMCC No. 1499为研究材料，采用抑制差减杂交技术(suppression subtraction hybridization, SSH)获得重组酵母生物合成麻黄碱时差异表达二氢鞘氨醇羟化酶基因片段，获得二氢鞘氨醇羟化酶基因片段片段长438bp，通过美国国立生物技术信息中心序列相似性搜索程序(NCBI Blast)的核酸序列分析，表明与数据库中仅有的Pichia ciferrii 二氢鞘氨醇羟化酶基因同源部分相似性为88%。由此证明从产麻黄碱重组酵母中分离的二氢鞘氨醇羟化酶基因片段是一个新的二氢鞘氨醇羟化酶基因。具体的，本专利技术提供了一种二氢鞘氨醇羟化酶基因的碱基序列全长为438bp，其编码由序列表中SEQUENCE LISTING所示的氨基酸序列中101个氨基酸组成的蛋白质。同时，本专利技术提供了一种二氢鞘氨醇羟化酶基因片断的获得方法，所述的二氢鞘氨醇羟化酶基因SUR2是来源于产麻黄碱的转基因重组酵母CGMCCNo. 1499，通过SSH实验获得。具体包括如下步骤1.采用低能氩离子(Ar+)注入介导野生蓝麻黄(Ephedra glauca L.)基因组DNA 在异常汉逊酵母(Hansenula anomala)中随机转化，转化后的酵母菌通过目标性状的筛选， 获得生物合成麻黄碱重组酵母菌株CGMCC No. 1499。2.将出发菌株和转基因酵母菌分别从斜面分别转接入液体培养基，置摇床230r/ minJ8°C 30°C培养72h，离心分别收集菌体。采用Takara RNAisoReagent对酵母总RNA进行提取，用的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，并用紫外分光光度计估计其纯度及浓度。以转基因酵母为实验组，出发菌株为驱动组，采用Clontech公司的PCR-klectTMcDNA Subtraction Kit和SMART PCRcDNA Synthesis Kit进行抑制差减杂交实验。将第二次 PCR的产物与pGEM-T Easy载体连接，连接产物转大肠杆菌XLlO-Gold感受态细胞，进行蓝白斑筛选，构建转基因酵母的差减文库。对差减文库中的重组子进行PCR鉴定，将鉴定后的重组子进行测序，测序获得一段438bp的基因片段，该基因片段包含一段ployA的特征序列，证明通过SSH实验分离的基因片段为该基因的3'端序列。测序结果用BLASTn程序在 GenBank数据库中进行序列相似性搜索，并根据比对结果进行功能预测，确定该基因片段为二氢鞘氨醇羟化酶基因。进一步，本专利技术提供了一种二氢鞘氨醇羟化酶，该二氢鞘氨醇羟化酶蛋白质的碱基序列和SEQUENCE LISTING所示的氨基酸序列，其来源于产麻黄碱的转基因重组异常汉逊酵母(Hansenula anomala) CGMCC No. 1499。通过实施本专利技术具体的
技术实现思路
，可以达到以下效果1.本专利技术提供了一种在产麻黄碱的转基因重组异常汉逊酵母中高表达的二氢鞘氨醇羟化酶基因序列和编码多肽序列，该二氢鞘氨醇羟化酶基因的碱基序列全长438bp，其编码由序列表中SEQUENCE LISTING所示的氨基酸序列中101个氨基酸组成的多肽。2.本专利技术提供的一种在产麻黄碱的转基因重组异常汉逊酵母中高表达的二氢鞘氨醇羟化酶基因及其二氢鞘氨醇羟化酶应用于麻黄碱次生代谢途径的研究，为麻黄碱代谢途径基因在异常汉逊酵母中的整合、表达以及调控研究奠定基础，也为二氢鞘氨醇羟化酶基因的相关研究领域提供新的基因资源。附图说明图1所示为利用抑制差减杂交技术获得的差异基因表达片段电泳结果图，其中，M 为DNA分子量标准DL2000，1为二氢鞘氨醇基因片段。图2所示为在发菌株和转基因菌株中鉴定二氢鞘氨醇羟化酶基因片段电泳结果图，M为λ-EcoTH I digest DNA Marker，1为从出发菌株内扩增出的二氢鞘氨醇片段，2 为从转基因酵母内扩增出的二氢鞘氨醇片段。具体实施例方式下面，举实施例说明本专利技术，但是，本专利技术并不限于下述的实施例。本专利技术中涉及到的主要原辅材料和设备有主要试齐[J =Takara 公司 rTaq DNA 聚合酶，RNAiso Reagent, Clontech 公司PCR-Select cDNA Subtraction Kit 和 SMARTtmPCR cDNA Synthesis Kit，Axygen 公司胶回收试剂盒，Promega公司pGEM-Τ克隆载体，主要仪器IBB Device 1多功能离子注入机，Sigma 3-18K离心机，UV-7M分光光度计，TC-512PCR 仪。本专利技术中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本专利技术的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本专利技术以下实施方式的实施。实施例一1.采用低能氩离子(Ar+)注入介导野生蓝麻黄(Ephedra glauca L.)基因组DNA 在异常汉逊酵母(Hansenula anomala)中随机转化，转化后的酵母菌通过目标性状的筛选， 获得生物合成麻黄碱重组酵母菌株CGMCC No. 1499。2.将出发菌株和转基因酵母菌分别从斜面分别转接入液体培养基，置摇床230r/ minJ8°C 30°C培养72h，离心分别收集菌体。采用T本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种二氢鞘氨醇羟化酶基因，其特征在于，所述的二氢鞘氨醇羟化酶基因片段的碱基序列全长为４３８ｂｐ，其编码由序列表中ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＬＩＳＴＩＮＧ所示的氨基酸序列中１０１个氨基酸组成的蛋白质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吕杰，毛培宏，金湘，马媛，
申请(专利权)人：新疆大学，
类型：发明
国别省市：65