鸡ＦＳＨＲ基因５′调控区两个突变位点的分子标记方法及其在鸡育种中的应用技术

本发明专利技术涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种鸡ＦＳＨＲ基因５′调控区突变位点的分子标记方法及其育种中的应用，发明专利技术人发现鸡ＦＳＨＲ　５′调控区－２３７和－８６８位点进行单个位点标记分析时，两位点均未发现与性状相关，但用两位点单倍型构建双倍型进行多重比较时，结果发现ＴＴＧ＋Ｇ－型对应较小的开产日龄（１２３ｄ），ＴＴＧ＋Ｇ＋型对应较大的开产日龄（１３４ｄ），两者差异显著（Ｐ＝０．０１６），可见检测这两个与产蛋性状相关联的分子标记，不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种鸡FSHR基因5′调控区的两个突变位点的分子标记方法及其育种中的应用。
技术介绍
促卵泡素(FSH)是调控动物繁殖活动的重要激素之一，对动物卵巢卵泡的生长、发育、分化、成熟和排卵起着必不可少的作用，其生物学功能的发挥通过位于靶细胞膜上的促卵泡素受体(FSHR)介导。有研究表明，FSHR基因5′端多态位点的基因频率，在产双胎和产单胎的中国西门塔尔牛群体中差异显著。研究发现，多胎罗曼诺夫羊发育卵泡颗粒细胞中的FSHR mRNA水平均显著高于单胎法兰西岛羊，且颗粒细胞对促性腺激素反应的敏感性，前者也高于后者。雷雪芹等用FSHR基因5′端侧翼序列的PCR-RFLP标记对牛进行了研究，结果在秦川牛和黑白花奶牛两个品种中出现优势等位基因不一致的现象，即在秦川牛中双胎母牛的A基因频率和AA基因型频率分别高于单胎母牛的A基因频率和AA基因型频率。魏伍川等发现小尾寒羊表现为无Taq I酶切序列的B等位基因类型，所有个体均为BB型，FSHR基因转录启动调控区的B型DNA序列对提高双胎率有正效应。目前，有关FSHR基因5′端的研究主要集中在哺乳动物，如：小鼠、牛、羊等，在禽类仅有报道产蛋鸡FSHR在成熟卵巢不同等级卵泡膜细胞和颗粒细胞上的表达，而有关FSHR 5′调控区序列多态性及其与产蛋性状关系的研究尚未见报道。基因表达是DNA上的遗传信息转录和翻译的过程，转录受基因5′端序列的调控，碱基突变通常会影响基因转录调控，因此5′端的序列结构变异直接关系到基因的表达。对不同突变位点进行整体研究，即由这些不同位点构成的单倍型，更有利于发现基因与某种表型的相关性。如药物代谢酶P450 2D6(CYP2D6)基因中存在3个SNPs，这3个SNPs中的任何一个对酶功能几乎没有影响，但是由它们构成的单倍型可使酶活性丧失80％左右，可见单倍型分析的重要性，张森等研究也表明单倍型相关性分析方法在QTL检测中要明显的优于单标记分析。而对于禽类，特别是鸡的FSHR基因5′调控区研究现在还相对较少，无法将其应用于鸡的育种等工作中。
技术实现思路
根据现有技术，专利技术人进行了进一步的研究和实验，最终发现鸡FSHR 5′调控区-237和-868位点进行单个位点标记分析时，两位点均未发现与性状相关，但用两位点单倍型构建双倍型进行多重比较时，结果发现TTG+G-型对应较小的开产日龄(123d)，TTG+G+型对应较大的开产日龄(134d)，两者差异显著(P＝0.016)，可见检测这两个与产蛋性状相关联的分子标记，不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。本专利技术的具体标记方法是：采用标记引物P-868，包括-->P-868F：5′-TGAGTCAACATCAGCAGAG-3′其序列如Seq ID No：1所示；P-868R：5′-GGAAGGAGTGTGAAGACC-3′其序列如Seq ID No：2所示；扩增鸡育种材料的基因组DNA，PCR扩增产物得到大小相差200bp的两个片段分别为1119bp的片段和919bp的片段(其序列如Seq ID No：3和Seq ID No：4所示)，PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测直接分出三种带型，200bp插入的记为G+G+型，200bp缺失的记为G-G-型，杂合子记为G+G-型；采用标记引物P-237，包括P-237F：5′-GGATCTATGAAGGGGAGCAT-3′其序列如Seq ID No：5所示；P-237R：5′-AAGCTGAGATGGAACACGTG-3′其序列如Seq ID No：6所示；扩增鸡育种材料的基因组DNA，得到371bp的PCR扩增产物(其序列如Seq ID No：7所示)，其中包含Ssp I限制性内切酶的识别序列“AAT/ATT”，当-237“T”突变为“A”即“AAT/AAT”类型记做“AA”，扩增片段Ssp I内切酶切不开；“T”不发生突变类型记做“TT”，可以被Ssp I内切酶切作235bp和136bp的两条短片段；PCR产物被Ssp I限制性内切酶消化后用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，即得到AA、TT、AT三种带型；选择两位点单倍型组合为TTG+G-的个体用于留种，其可提高总体产蛋量。通过这种标记方法选择的TTG+G-基因型种鸡能兼顾开产日龄和产蛋数，在产蛋性能低的地方品种中有意增加TTG+G-的频率对提高产蛋量是一个有效措施，而对于开产较晚的群体，这样的措施会使其开产适当提前，从而实现早期选种。(四)附图说明图1为FRP1和FRP2引物PCR扩增的片段电泳图，其中I为FRP1引物扩增的片段的电泳图，II为FRP2引物扩增的片段的电泳图；图2为鸡FSHR 5′调控区-237位点的多态性检测电泳图；图3为鸡FSHR 5′调控区-868位点的多态性检测电泳图；图4为定点突变后序列比对结果，图中第1038位点为定点突变位点；图5为重组载体质粒用Bgl II和Kpn I双酶切鉴定结果电泳图，图中1-4、6为AG+和TG+单倍型，5、7-12为TG-和AG-单倍型；图6为培养72h的鸡卵泡颗粒细胞图片，为采用100倍镜观察获得；图7为四种单倍型对荧光素酶报告基因启动活性检测结果示意图；图8为三种基因型FSHR mRNA在新杨褐白卵泡中的表达，统计学显示含不同字母间差异显著(P＜0.05)。(五)具体实施方式实施例1  鸡FSHR 5′调控区序列的克隆测序、序列比对及突变位点分析根据已发表红色原鸡序列(GenBank Accession No.NW_060321)设计两组引物FRP1(其序列如Seq ID No：8和Seq ID No：9所示)和FRP2(其序列如Seq ID No：10和Seq ID No：11所示)，这两种引物是为研究鸡FSHR 5’调控区的突变而根据数据库中登录的红色原鸡的序列特意设计的，并且重叠19bp以利于序列的组装。两对引物分别扩增了四-->个地方品种：济宁百日鸡，文昌鸡，仙居鸡，藏鸡和一个商品代蛋鸡海兰褐FSHR 5’调控区相互重叠的上游(-1824bp～-940bp)和下游(-960bp～-40bp)两段序列。FRP1引物扩增的片段1约885bp(图1I)，FRP2引物扩增的片段2有2个，大小约为919bp和1120bp上游和下游序列(片段1和片段2，图1II)，PCR扩增产物经1.2％琼脂糖电泳分离后切取目的带，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver.2.0，TaKaRa)纯化PCR产物，纯化产物连接到pMD18-T载体(TaKaRa)，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，包含目的片段的重组质粒纯化后测序。表1引物的序列、位置和退火温度 引物名称 Primer name  引物序列  Primer sequences(5′-3′)  引物位置  Primer position  退火温度  Annealing Temp.  FRP1  56℃  forward  CAGGTTGAAGGTATGGCTTAC  -1824～-1804  reverse  CTCTGCTGATGTTGACTCAC  -959～-940本文档来自技高网...

【技术保护点】
鸡ＦＳＨＲ基因５′调控区两个突变位点的分子标记方法，具体标记方法是：采用标记引物Ｐ－８６８，包括Ｐ－８６８Ｆ，其序列如Ｓｅｑ　ＩＤ　Ｎｏ：１所示；Ｐ－８６８Ｒ，其序列如Ｓｅｑ　ＩＤ　Ｎｏ：２所示；扩增鸡育种材料的基因组ＤＮＡ，ＰＣＲ扩增产物得到大小相差２００ｂｐ的两个片段分别为１１１９ｂｐ的片段和９１９ｂｐ的片段，其序列分别如Ｓｅｑ　ＩＤ　Ｎｏ：３和Ｓｅｑ　ＩＤ　Ｎｏ：４所示，ＰＣＲ产物在１．２％的琼脂糖凝胶电泳检测直接分出三种带型，２００ｂｐ插入的记为Ｇ＋Ｇ＋型，２００ｂｐ缺失的记为Ｇ－Ｇ－型，杂合子记为Ｇ＋Ｇ－型；采用标记引物Ｐ－２３７，包括Ｐ－２３７Ｆ，其序列如Ｓｅｑ　ＩＤ　Ｎｏ：５所示；Ｐ－２３７Ｒ，其序列如Ｓｅｑ　ＩＤ　Ｎｏ：６所示；扩增鸡育种材料的基因组ＤＮＡ，得到３７１ｂｐ的ＰＣＲ扩增产物，其序列如Ｓｅｑ　ＩＤ　Ｎｏ：７所示，其中包含Ｓｓｐ　Ｉ限制性内切酶的识别序列“ＡＡＴ／ＡＴＴ”，当２３７“Ｔ”突变为“Ａ”即“ＡＡＴ／ＡＡＴ”类型记做“ＡＡ”，扩增片段Ｓｓｐ　Ｉ内切酶切不开；“Ｔ”不发生突变类型记做“ＴＴ”，可以被Ｓｓｐ　Ｉ内切酶切作２３５ｂｐ和１３６ｂｐ的两条短片段；ＰＣＲ产物被Ｓｓｐ　Ｉ限制性内切酶消化后用１．５％琼脂糖凝胶电泳检测，即得到ＡＡ、ＴＴ、ＡＴ三种带型。...

【技术特征摘要】
1.鸡FSHR基因5′调控区两个突变位点的分子标记方法，具体标记方法是：采用标记引物P-868，包括P-868F，其序列如Seq ID No：1所示；P-868R，其序列如Seq ID No：2所示；扩增鸡育种材料的基因组DNA，PCR扩增产物得到大小相差200bp的两个片段分别为1119bp的片段和919bp的片段，其序列分别如Seq ID No：3和Seq ID No：4所示，PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测直接分出三种带型，200bp插入的记为G+G+型，200bp缺失的记为G-G-型，杂合子记为G+G-型；采用标记引物P-237，包括P-237F，其序列如Seq ID No：5所示；P-237R，其序列如Seq ID No...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜运良，康丽，张宁波，唐辉，张渝洁，刘东君，王慧，梁森，藏丽，李标，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：37[]