具有抗血管生成活性和肿瘤消退作用的鲨鱼软骨提取物及其制备方法技术

本发明专利技术涉及鲨鱼软骨提取物及其制备方法，这些提取物具有抗血管生成特性（在体内观察到减少实验诱发性肿瘤的血管壁面积）和体内的肿瘤消退活性，并且对肿瘤细胞系显示出直接抑制作用。该方法不涉及任何变性溶剂或产物，也不涉及使用任何酶。它由下述步骤组成：在中性ｐＨ水，优选纯水溶液中得到全软骨混合物，将混合物离心，沉淀碎片和上清液待进一步处理。将碎片冻干，测定冻干物和上清液或者冻干物的体内和体外抗肿瘤和抗血管生成活性。上清液表现出体内抗血管生成和抗肿瘤活性。使用不同方法研究上清液的组成。分馏该上清液表征出其中的数种活性成分。试验馏分在体外对癌细胞系的直接活性。由此可认为未分馏的上清液也具有这种体外活性。冻干在很大程度上破坏了这些馏分的活性，但在固体提取物却没有观察到这种活性的消失。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
软骨是一种无血管组织，人们将其作为一种含有抗血管生成因子的潜在物质加以研究。它还是一种相对抵抗肿瘤生长的组织。涉及软骨的肿瘤，软骨肉瘤是一种血管最少的固体肿瘤。血管生成是肿瘤发展的一个重要因子。如果肿瘤细胞能激发扩大相邻的血管网以供给其营养需求，就会出现分散的固体肿块。因此，研究涉及刺激血管生成的因子对肿瘤生长的作用，研究抗血管生成因子及具有血管生成抑制活性的药物并以其作为控制肿瘤生长或使肿瘤消退的工具。已经发现鲸仔的肩胛软骨含有一种抑制固体肿瘤中血管形成的物质(Langer等，1976)。由于这种物质作为抗肿瘤剂的潜在可能性，鼓舞着人们去寻找更广泛的软骨来源。鲨鱼是这种血管生成抑制剂的可能来源之一，因为其内骨骼完全由软骨组成(占其体重的6％，而鲸仔中的软骨仅占其体重的0.6％)。鲨鱼还有一个令人感兴趣的特点，即其生长肿瘤的低倾向性。已有许多假设推测解释这种鲨鱼中生长肿瘤的低可能性。Marchalonis等(1990)显示IgM抗体能迅速攻击任何入侵性物质。Mckinney等(1990)也表明鲨鱼的巨噬细胞可将瘤细胞分化为普通细胞，从而破坏瘤细胞。Rosen和Woodhead(1980)假设elasmobranchs(一组附属于鲨鱼和鹞鱼的动物)中肿瘤的低发性可能是由于其组织中的高离子强度所致，这与其较高的体温相当。在这种情况下，这些作者认为免疫系统发挥着接近100％的免疫监视作用。Moore等(1993)年发现鲨鱼产生一种具有抗菌和抗原虫特性的氨基甾醇。最终，Lee和Langer(1983)及Klagsbrun(1987)显示鲨鱼产生一种抑制新血管形成的物质。Lee和Langer(在所引的书中)在变性条件下从鲨鱼软骨中提取分离出这种物质(胍提取)。但是该提取过程很长(41天)，并且会产生变性的提取物。从鲸鱼分离的活性物质的分子量为约16千道尔顿(kd)，但同组研究人员却未能获得从鲨鱼中得到的活性物质的精确分子量。对该种物质的定义仅限于其分子量大于3500道尔顿。Oikawa等(1990)应用Lee和Langer所述的一种相同提取方法，但时间要短的多(2天代替41天)。由Oikawa等从鲨鱼软骨中分离的物质的分子量为1000-10000道尔顿。Schinitsky(USP4,473,551)描述了一种鲨鱼软骨粉的水提物，其大于100,000道尔顿的馏分单独或与葡糖胺结合具有抗炎活性。但该专利并未提示该提取物中的一种组份具有抗血管生成和抗肿瘤活性。Kuetner等(USP 4,746,729)从牛的软骨中分离出多形核中性白细胞(PMN)弹性蛋白酶抑制剂。该抑制剂是从软骨的水提物中得到的，由其获得的分子量大于50,000道尔顿。在Sephacryl S-200上分级分离得到许多馏分，在证实其具有抗弹性蛋白酶活性后，合并其中分子量为10-40千道尔顿的馏分。该活性成分的等电点是9.5，可能具有的分子量为约15,000道尔顿。Kuetner(USP 4,042,457)还表明一种分子量小于50,000道尔顿的分子量的牛软骨成分具有细胞增殖抑制活性，但对内皮细胞的生长不具有任何活性。Spilburg等(4,243,582)从牛软骨中分离出两种分子量为65KD，PI为3.8的糖蛋白(胍提取)，这两种蛋白表现出抗胰蛋白酶活性和内皮细胞生长抑制活性。鲸鱼和鲨鱼软骨具有多种活性，如溶菌酶活性，细胞生长促进活性，对I型和IV型胶原酶及弹性蛋白酶的抑制活性，和对蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶和血浆酶的抑制活性。获得鲨鱼软骨提取物和馏分的方法是已知的。其中的一些方法是生产软骨粉原料，而不是任何提取物(USP 5,075,112)；其它一些方法使用了变性试剂，如胍(USP 4,243,582)；或酶反应除去包围软骨的肌肉、神经或血管结构，及有机溶剂除去脂肪(USP 3,478,146，4,350,682和4,656,137)，从而获得软骨提取物；而其它一些方法仅除去不溶物简单地制备软骨的水提物(水(USP 4,473,551)或盐溶液中(USP 4,746,729))。在后一种方法中获得一定分子量的特定馏分以待进一步研究和纯化(参见上述讨论)。总之，已知鲨鱼软骨含有抗血管生成成分，成分的活性通常用兔角膜袋测定法和鸡绒膜尿囊膜(CAM)测定法进行测试。至今，已直接测试了软骨全粉在体内对肿瘤的作用，对移植到裸鼠中的异种移植物人黑素瘤的作用(USP 5,075,112)及在CAM中测试了其抗血管生成作用。但没有证据表明软骨提取物对肿瘤细胞具有直接作用。血管生成作用不仅仅涉及到癌的生长。影响不同生理系统(以括弧表示)的许多疾病或病症都是血管生成依赖性的，这些疾病或病症的实例关节炎和动脉粥样硬化斑(骨和韧带)，糖尿病性视网膜炎，新血管性青光眼，砂眼和角膜移植性新血管生成(眼)，牛皮癣，硬皮病，血管瘤和疤痕体质(皮肤)，血管粘连和血管纤维瘤(血液系统)。因此，发现任何新的抗血管生成因子都具有治疗这些疾病和癌症的用途。专利技术概述本专利技术涉及一种具有抗血管生成特性(在体内观察到减少实验诱发性肿瘤的血管壁面积)，体内肿瘤消退活性并对肿瘤细胞系显示出直接抑制作用的提取物的制备方法。这些提取物来自通称为多刺角鲨和黑刺角鲨(Squalusacanthias)的鲨鱼软骨。该方法不涉及任何变性溶剂或产物，也不涉及使用任何酶。它由下述步骤组成在中性PH水，优选纯水溶液中得到全软骨混合物，将混合物离心，沉淀碎片和上清液待进一步处理。将碎片冻干，测定冻干物和上清液或者冻干物的体内和体外抗肿瘤和抗血管生成活性。上清液表现出体内抗血管生成和抗肿瘤活性。使用不同方法研究上清液的组成。分馏该上清液表征出其中的数种活性成分。试验馏分在体外对癌细胞系的直接活性。由此可认为未分馏的上清液也具有这种体外活性。冻干在很大程度上破坏了这些馏分的活性，因此值得强调的是固体和液体提取物及其馏分之间存在明显不同。本专利技术还涉及软骨冻干物或固体提取物，软骨提取液和其馏分，及获得所有这些物质的方法。最后，本专利技术涉及软骨提取物在治疗血管生成依赖性疾病中的应用。初步临床试验表明含有浓缩的未分离提取液的药物组合物能改善患血管生成依赖性疾病的患者的症状。在所述疾病中，皮肤性疾病如牛皮癣和一例前列腺癌得以成功地治疗。另外，还意外地成功地治疗了未确证为血管生成依赖性疾病的另一种皮肤病，粉刺。过度新血管形成被认为是烧伤患者疤痕肥大的特征。经试验，含有本专利技术软骨提取物的组合物可防止这种现象。提供含有液体软骨提取物为活性成分的药物组合物也是本专利技术的目的之一。附图概述由下图补充说明的具体实施方案将使本专利技术更易于理解，这些附图旨在说明本专利技术而不是限制本专利技术的范围附附图说明图1表示鲨鱼软骨(固体提取物)剂量的增加对ZR75-1和MCF-7细胞的抑制活性。附图2表明在浓度增加的雌二醇本身或雌二醇与两种浓度的软骨冻干物的存在下，通过其DNA含量测定的MCF-7的量的剂量依赖性曲线。附图3a)和b)显示经管饲给予软骨冻干物和上清液与仅给予水的生长乳腺癌的大鼠肝切片的比较。附图4a)和b)显示经管饲给予软骨冻干物和上清液与仅给予水的生长乳腺癌的大鼠肾切片的比较。附图5a)和b)显示经管饲给予软骨冻干物和上清本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提取液，它基本上由上清液馏分组成，可通过以下方法得到：将全鲨鱼软骨的含水匀浆离心后，至少进行一次分级，一种分级是经分子量截留值为５００千道尔顿（ＫＤａ）的膜分离，该馏分中分子的分子量低于５００ＫＤａ，所述提取液包括一种具有可独立于抗血管生成活性的直接抗肿瘤活性的组分。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：E杜邦，P布拉泽奥，C朱尼奥，
申请(专利权)人：莱斯实验室阿特纳公司，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]