使用有机溶剂制备的软骨提取物制造技术

本发明专利技术涉及一种使用含有机溶剂的溶液替代纯水来制备软骨提取物及其馏分的方法。对用于制备含生物活性物质提取物的不同有机溶剂进行测试。在这些所测试的溶剂中，４０％的三甲胺（在水溶液中）是替代纯水的理想溶剂，尤其是在回收对ＨＵＶＥＣｓ的抗增生活性物质上。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种从软骨组织中提取生物活性组分的方法。尤其是，本方法利用了与水结合的有机溶剂，或未与水结合的有机溶剂。有机溶剂在损失其它活性组分的情况下，选择性地提取出某些活性组分。由此获得了富含某些蛋白的提取物，或具有某些活性的提取物，可以是抗金属蛋白酶(称为抗-MMP-2)活性、抗弹性蛋白酶(称为抗-PPE)活性，或针对HUVECs的抗增生活性。
技术介绍
制备鲨鱼软骨提取物的方法以及提取物本身在已被国际申请WO 95/32722，WO 96/23512和WO 97/16197所公开。鲨鱼的软骨提取物已被用来检测抗血管生成(antiangiogenic)、抗溶胶原(anticollagenolytic)、直接的抗肿瘤增生和抗炎活性。WO 95/32722公开了一种制备具有抗血管生成、体外直接抗肿瘤增生和体内抗肿瘤活性的鲨鱼软骨提取物的方法。该制备方法包括将鲨鱼组织混合，在水中将其碎成500μm大小的颗粒；其中的活性组分被抽提至水中；分馏提取物，按顺序获得分子量小于500Kda(0-500馏分)的分子。将液体软骨提取物在具有额定孔率(nominal porosity)约为1Kda的膜上浓缩，形成了含有分子量小于约500KDa的分子的浓缩液体提取物。该提取物富含分子量为1-500KDa的分子。0-500的馏分进一步经过分馏，以形成含有分子量在1-120KDa的抗肿瘤增生分子的多级提取物。专利WO95/32722并没有公开回收分子量小于1KDa的组分的特殊过程。并且，它也没有公开通过含有机溶剂的溶液来获得软骨提取物或其馏分的方法。国际申请WO 96/23512公开了一种在水溶液中提取任何软骨来源的生物活性组分的方法。此外，该出版物还公开了和液体鲨鱼软骨相关的其它生物活性，例如抗溶胶原和抗炎活性。WO96/23512并没有公开获得分子量小于1KDa的组分的方法，也没有描述使用含有机溶剂的溶液的过程。国际申请WO 97/16197公开了一种制备富含分子量为0.1-500KDa分子的液态提取物的方法。尽管该方法会获得分子量小于1KDa的组分，但它并没有提供获取分子量特别低的组分的方法。该专利文件也未公开任何分离和纯化的组分形式。人们广泛认为基质金属蛋白酶和新血管形成过程相关，促进肿瘤初期生长和形成转移癌(metastases)。相应的，具有抗血管生成和/或抗基质金属蛋白酶活性的化合物或制剂被认为至少具有下述一种作用抑制新血管形成、抑制肿瘤生长、抑制细胞的转移性入侵、抑制转移癌的形成和治疗与血管生成相关的疾病。由于现在对鲨鱼软骨研究兴趣的增加，迫切需要有改进的方法用于制备、分离、纯化以前未知的具有生物活性的组分。专利技术概述本专利技术提供了一种制备鲨鱼提取物的改进方法。一方面，本专利技术提供了一种制备含有生物活性组分的鲨鱼提取物及其馏分的方法，该方法使用了许多条件。在一种实施方式中，本专利技术提供了一种制备鲨鱼提取物的方法，该提取物中至少含有抗-MMP、抗-PPE和针对HUVECs的抗增生活性组分。该方法使用了有机溶剂。这些溶剂用来替代纯水。相对于其它组分，这些溶剂允许对某些可溶性生物活性组分进行选择性富集，而在用纯水提取的过程中，所有的这些其它组分都会被提取出来。在另一个方面，本专利技术提供了一种方法，该方法将源于鲨鱼软骨液态提取物的生物活性组分中的0-500分子量的馏分分成两部分，其中，第一部分含有分子量小于1KDa(0-1馏分)的组分，第二部分含有分子量为1-500KDa(1-500馏分)的组分。为了将组分的聚集现象减到最小，改善溶解性以及保持稳定的溶液形式，可在0-500，0-1和1-500的馏分中加入足够稳定量的蔗糖、或下述一种或几种合适的稳定剂，例如，右旋糖苷(dextran)、FicollTM、果糖、凝胶、葡萄糖、甘氨酸、纤维醇、乳糖、甘露醇和山梨糖醇，也可在制备过程中的任何步骤加入。此处所提到的馏分、溶液或提取物，用语“含1％w/v的蔗糖”指代含有大约1％w/v蔗糖的单独的馏分、溶液或提取物。在0-500、0-1和1-500馏分的生物活性组分具有抗-MMP、抗弹性蛋白酶和抗血管生成活性。溶剂和它们在水中的浓度会影响提取物的性质。另一方面，本专利技术提供了一种来源于鲨鱼软骨的分子量大约为244amu(原子质量单位)的组分，在此称之为AE-986，它具有抗-MMP和抗-肿瘤活性中的至少一种。用来纯化AE-986的材料和方法揭示了该物质的某些物化特性，这些特性决定了分离该组分所用的不同的溶剂相和层析系统。本专利技术还提供了一种分离和纯化AE-986组分的方法，或分离和纯化任何源于鲨鱼的相应组分的方法。本专利技术的另一方面提供了一种源于鲨鱼的纯化的生物活性化合物，它对应于源于鲨鱼软骨的分子量为244amu并具有抗-MMP活性的化合物。另一方面，本专利技术提供了一种抑制MMP酶的方法，该方法包括将可被该酶切割的底物与有效量的一种或多种鲨鱼提取物或馏分相接触。本专利技术还提供了抑制新血管形成和转移癌形成的方法，该方法包括如下步骤将靶组织与有效量的鲨鱼提取物、溶液、匀浆、悬浮液、馏分诸如0-500、0-1、1-500的馏分，或含1％W/V蔗糖的相同馏分相接触。附图简要说明下面的附图是本说明书的一部分，用来进一步阐述本专利技术的某些方面。结合这些图以及具体实施方式的详述将更有助于理解本专利技术。附图说明图1为在PPE酶实验中导致50％抑制的不同鲨鱼软骨提取物的浓度(μg/ml)。已标出随溶剂浓度增加而变化的IC50。图2为在MMP-2酶实验中导致50％抑制的不同鲨鱼软骨提取物的浓度(μg/ml)。已标出随溶剂浓度增加而变化的IC50。图3为在HUVEC酶实验中导致50％抑制的不同鲨鱼软骨提取物的浓度(μg/ml)。已标出随溶剂浓度增加而变化的IC50。图4表示HPSEC长度比率和不同溶剂中获得的提取物的蛋白量之间的关系。图5表示HPSEC矢量角和不同溶剂中获得的提取物的蛋白量之间的关系。专利技术详述生物学检测鲨鱼软骨提取物、所得的馏分以及AE-986组分的生物特性可通过下述的至少一种检测方法测得白明胶酶抑制检测(GIA)测定抗-MMP活性的检测试验；胚胎血管形成检验(EVT)测定抗血管生成活性的检测试验；和Lewis肺癌转移小鼠模型(LLC)测定抗-肿瘤活性的检测试验GIA使用商品化试剂盒(Boehringer Mannheim)来做GIA。GIA用来检测鲨鱼软骨提取物、所得的馏分以及AE-986组分对白明胶酶A(MMP-2)活性的抑制能力。简单地说，GIA检测过程如下。在液体软骨提取物或其衍生物存在或不存在的情况下，将生物素标记的白明胶底物和白明胶酶A一起孵育培养。接着，将反应混合物加载到链霉抗生素蛋白(streptavidin)包埋的微量滴定板(microtiter plate)里。生物素标记的白明胶通过游离的生物素残基联到链霉抗生素蛋白包埋的微量滴定板上。如果底物白明胶没有被白明胶酶切割，则链霉抗生素蛋白-过氧化物酶(POD)缀合物连接到白明胶酶-生物素-复合物上。POD然后将所加的ABTS底物转化成绿色的终产物，它在405nm下测定。但是，如果生物素标记的白明胶被白明胶酶所切割，则只能形成很小的白明胶片段。这些片段结合到微量滴定板后，不具有结合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从软骨中制备富含可溶性生物活性组分的提取物的方法，包括如下步骤：ａ）用一定量的含有机溶剂的溶液处理鲨鱼软骨材料，相对于所述溶液中的其它软骨组分，该有机溶剂对所述的可溶性组分进行选择性富集，形成了含鲨鱼软骨可溶性组分的第一混合物； ｂ）分离所述的第一混合物，形成含有所述可溶性组分的第一种液态提取物，以及第一种固体物质，其中所述的可溶性组分具有至少抗基质金属蛋白酶或抗增生的活性。

【技术特征摘要】
US 2001-2-5 09/776,7651.一种从软骨中制备富含可溶性生物活性组分的提取物的方法，包括如下步骤a)用一定量的含有机溶剂的溶液处理鲨鱼软骨材料，相对于所述溶液中的其它软骨组分，该有机溶剂对所述的可溶性组分进行选择性富集，形成了含鲨鱼软骨可溶性组分的第一混合物；b)分离所述的第一混合物，形成含有所述可溶性组分的第一种液态提取物，以及第一种固体物质，其中所述的可溶性组分具有至少抗基质金属蛋白酶或抗增生的活性。2.权利要求1所述的方法，进一步包括步骤a)从所述的第一种液态提取物中去除足够量的液体，以形成实质上是干的第二种固体物质；b)在上述的第二种固体物质中加入水，形成第二混合物；和c)分离所述的第二混合物，形成第一种最终液态提取物和第三种固体物质，其中所述的最终液态提取物包含所述可溶性组分。3.权利要求1所述的方法，进一步包括步骤从所述的第一种液态提取物中去除所有的有机溶剂。4.权利要求1所述的方法，其中所述含有机溶剂的溶液包括一种或多种碱性、酸性、卤化、醚、质子、非质子、极性、非极性、亲水或疏水溶剂。5.权利要求1所述的方法，其中所述含有机溶剂的溶液包括一种或多种选自下述的有机溶剂三甲基胺(TMA)、氢氧化铵、三氟乙酸(TFA)、甲酸、氯仿、二溴甲烷、丁基氯和二氯甲烷、二甲氧基甲烷、四氢呋喃、二乙醚、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、二乙二醇二乙醚、三乙二醇二甲醚、叔-丁基乙醚、叔-丁基甲醚、甲醇、乙醇、2-硝基乙醇、2-氟乙醇、2，2，2-三氟乙醇、乙二醇、1-丙醇、2-丙醇、2-甲氧基乙醇、1-丁醇、2-丁醇、异-丁醇、叔-丁醇、2-乙氧基乙醇、二乙二醇、1-，2-，或3-戊醇、新戊醇、叔-戊醇、二乙二醇单甲基醚、二乙二醇单乙基醚、环己醇、苯甲醚、苯甲基醇、苯酚或丙三醇、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMAC)、1，3-二甲基-3，4，5，6-四氢-2(1H)嘧啶酮(DMPU)、1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMI)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、甲酰胺、N-甲基乙酰胺和N-甲基甲酰...

【专利技术属性】
技术研发人员：E杜邦，Y拉昌斯，D莱萨德，S奥格，
申请(专利权)人：莱斯实验室阿特纳公司，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]