本发明专利技术涉及ｓｉＲＮＡ领域，公开了抑制人Ｅｚｒｉｎ基因表达的ｓｉＲＮＡ在食管癌细胞移动侵袭研究中的应用。本发明专利技术设计、合成了靶向人Ｅｚｒｉｎ基因的两对ｓｉＲＮＡ，并成功构建了它们在哺乳动物细胞内的表达载体。同时，运用这些ｓｉＲＮＡ可以有效、特异地干扰Ｅｚｒｉｎ的表达，建立了食管癌Ｅｚｒｉｎ低表达细胞株，为深入研究食管癌及其它Ｅｚｒｉｎ相关肿瘤中Ｅｚｒｉｎ的功能打下了坚实的基础。本发明专利技术还研究了Ｅｚｒｉｎ与食管癌细胞粘附以及移动侵袭的关系，为揭示食管癌的发病机制以及食管癌的治疗提供了重要线索。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及siRNA领域，具体地说，涉及抑制人Ezrin基因表达的siRNA在食管癌细胞移动侵袭研究中的应用。
技术介绍
RNAi是由双链RNA介导的同源靶基因转录后沉默的过程，RNAi可以通过人为的引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA，诱导内源靶基因mRNA降解，从而达到减少基因表达的目的。RNAi技术作为新兴的基因阻断技术，具有明显的优势，它具有高度的特异性，干扰效率高而且操作简单。因此以及广泛的应用于基因功能研究以及抗病毒感染、肿瘤治疗等热点领域。食管癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，严重影响人类健康。全世界食管癌患者术后5年生存率仅为20％-30％。造成食管癌预后差的一个重要原因是其转移性强，有些病人甚至在确诊时已经发生了局部组织浸润和淋巴结的转移。侵袭和转移是多因素参与的、多步骤完成的分子生物学变化过程。肿瘤细胞具有很强的迁移能力，使得它能克服细胞与细胞间以及细胞和基质间的粘附作用侵入周围组织。侵袭性强的细胞通常都有细胞突触多、细胞间粘附减弱以及通讯连接丧失等特点。现在普遍认为肿瘤细胞的这些恶性征是由于肌动蛋白结合蛋白以及一些相关的连接蛋白引起的细胞骨架重组所致。在这些骨架相关蛋白中，我们研究的是Ezrin。Ezrin基因又称VIL2，定位于染色体6q25.2～q26，其表达产物Ezrin蛋白是ERM(ezrin-radixin-moesin)家族成员之一，主要参与细胞中细胞骨架与胞膜之间的连接，具有维持细胞形态和运动、连接粘附分子及调节信号转导等功能。越来越多的证据表明Ezrin调控肿瘤发展。转移与非转移肿瘤细胞系及组织样品中基因表达的对比结果显示，来自啮齿动物乳腺、人胰腺和结肠的癌转移细胞中Ezrin的表达显著提高；同时，Ezrin在多种人类肿瘤中强烈表达，这些肿瘤包括骨肉瘤、黑色素瘤、星形细胞瘤、胰腺癌、肺癌、子宫内膜癌等；进一步的研究显示抑制Ezrin蛋白能消除鼠科动物横纹肌肉瘤和骨肉瘤细胞，Ezrin很可能是恶性肿瘤的关键调节分子。现有的研究还提示Ezrin参与肿瘤细胞的粘附、凋亡尤其是移动侵袭等生物学过程，并与肿瘤的发生发展密切相关。食管癌中Ezrin的表达情况最近才得到了初步的阐明，在我们以往的研究中发现在永生化食管上皮细胞SHEE向食管癌细胞SHEEmt的恶性转化过程中Ezrin发挥着重要的作用。我们最近对食管癌临床组织样本的研究也揭示食管癌中Ezrin的表达模式发生了改变。然而，Ezrin在食管癌及其它肿瘤中的功能及其表达改变的机制至今仍未得到很好的阐明。如能应用RNAi技术来抑制食管癌细胞中Ezrin基因的表达，从而探讨Ezrin在食管癌细胞中的功能，这将有助于从分子水平阐明Ezrin在这些上皮来源的肿瘤组织细胞表达改变的机制，从而为揭开食管癌的发病机制及治疗提供有用的线索。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供抑制人Ezrin基因表达的siRNA在食管癌细胞移动侵袭研究中的应用。本专利技术的上述目的可以通过以下措施实现。设计抑制Ezrin基因表达的双链siRNA片段依据Dharmacon公司在网上提供的设计软件设计了两组siRNA。其碱基序列及作用部位如下E1(SEQ ID NO1)5’GATCCCCTCCACTATGTGGATAATAATTCAAGAGATTATTATCCACATAGTGGATTTTTGGAAA 3’5’AGCTTTTCCAAAAATCCACTATGTGGATAATAATCTCTTGAATTATTATCCACATAGTGGAGGG 3’作用于人Ezrin mRNA的第274-292；E2(SEQ ID NO2)5’GATCCCCACTTTGGCCTCCACTATGTTTCAAGAGAACATAGTGGAGGCCAAAGTTTTTTGGAAA 3’5’AGCTTTTCCAAAAAACTTTGGCCTCCACTATGTTCTCTTGAAACATAGTGGAGGCCAAAGTGGG 3’作用于人Ezrin mRNA的第265-283。本专利技术的可以产生抑制人Ezrin基因表达的siRNA的载体，其具有以下的基本结构由启动子、Ezrin编码区、终止密码、DNA序列顺序连接而成的环状双链DNA分子；启动子为可启动产生siRNA的序列，它是启动它的下游紧邻之基因的表达的元件；启动子优选polymerase-III H1-RNA基因启动子。Ezrin编码区为表达权利要求1所述的siRNA的编码区，由19个核苷酸组成，可采用双向结合或以发夹状结构在细胞内形成双链RNA；终止密码为5～6个T；DNA序列为任何真核质粒载体和/或病毒的介于RNA编码区和启动子之间的DNA序列，含有质粒载体DNA的复制起始位点，或含有抗生素抗性基因，包括使细菌获得对抗某种抗生素的抗性的基因或使真核细胞获得某种抗生素的抗性的基因。所述任何真核质粒载体和/或病毒优选pSUPER.neo载体。所述抗生素抗性基因优选抗生素G418抗性基因neo。上述载体pSUPER.neo(Oligoengine)具有以下优点(1)具有polymerase-IIIH1-RNA基因启动子，可以产生一个不含多聚腺苷酸尾的小RNA转录子；(2)可以很精确的启动转录；(3)终止信号包含有T5；(4)在第二个尿嘧啶的后面终止转录，可以产生和合成的siRNA相类似的末端，即3’端含两个不配对的胸腺嘧啶或尿嘧啶。这个载体能在哺乳动物细胞里面稳定的表达siRNA，而且还含有neo基因，可以用G418筛选转染成功的细胞，建立细胞系，适合于做长期的研究。根据pSUPER.neo载体图，我们在线性化载体时采用依次酶切法。同时由于插入siRNA后的载体其Bgl II的酶切位点将被破坏，因此我们在连接后转化之前重新用Bgl II处理半小时，把自身环化的载体重新酶切成线性，以降低平板克隆生长背景，大大提高阳性质粒的筛选的效率。阳性质粒经EcoRI和Hind III酶切后可获得一287bp的片断，而空载体则可切出一227bp的片断，因此我们采用了更为敏感的非变性聚丙烯电泳加银染鉴定的办法进行重组子的筛选。将构建好的表达载体转染进食管癌细胞系EC109。为获得稳定表达质粒的细胞，我们首先使用浓度较高的G418进行药物筛选。转染空白质粒PSC和转染以上siRNA的细胞(分别称为PSE1和PSE2)的EC109细胞，由于质粒载体上有neo基因，具有G418抗性，因此得以存活；而相比之下，未转染上述质粒的对照EC109细胞则因G418的毒性作用而被杀死。为防止连续传代培养过程中，表达质粒的丢失，仍将细胞置于药物浓度相对较低的生长环境中培养，如果质粒丢失，细胞仍会因G418的毒性作用而被杀死。在上述条件下，细胞能够持续生长，表明稳定转染空白质粒和干扰质粒的EC109细胞株已被成功建立。筛选出来的细胞株首先进行干扰效果的分析。本专利技术用RT-PCR和Western blotting分别从转录和翻译水平进行分析。结果显示无论是在转录水平还是在翻译水平，干扰后的细胞Ezrin表达均明显降低，而且转染空白质粒的细胞Ezrin基因的表达未受影响，结果同时还显示干扰效果的比较为PSE1＞PSE2。此外，连续几代的细胞总蛋白中Ezrin表达的检测也显示干扰的效果非常的稳本文档来自技高网...
【技术保护点】
抑制人Ｅｚｒｉｎ基因表达的ｓｉＲＮＡ在食管癌细胞移动侵袭研究中的应用，所述抑制人Ｅｚｒｉｎ基因表达的ｓｉＲＮＡ是下列双链ＲＮＡ中的一种或两种，其碱基序列及作用部位如下：Ｅ１：５’ＧＡＴＣＣＣＣＴＣＣＡＣＴＡＴＧＴＧＧＡＴＡＡＴＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＴＡＴＴＡＴＣＣＡＣＡＴＡＧＴＧＧＡＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ３’５’ＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＴＣＣＡＣＴＡＴＧＴＧＧＡＴＡＡＴＡＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＴＡＴＴＡＴＣＣＡＣＡＴＡＧＴＧＧＡＧＧＧ３’作用于人ＥｚｒｉｎｍＲＮＡ的第２７４－２９２；Ｅ２：５’ＧＡＴＣＣＣＣＡＣＴＴＴＧＧＣＣＴＣＣＡＣＴＡＴＧＴＴＴＣＡＡＧＡＧＡＡＣＡＴＡＧＴＧＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡ３’５’ＡＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＧＧＣＣＴＣＣＡＣＴＡＴＧＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡＡＣＡＴＡＧＴＧＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＧＧＧ３’作用于人ＥｚｒｉｎｍＲＮＡ的第２６５－２８３。
【技术特征摘要】
1.抑制人Ezrin基因表达的siRNA在食管癌细胞移动侵袭研究中的应用，所述抑制人Ezrin基因表达的siRNA是下列双链RNA中的一种或两种，其碱基序列及作用部位如下E15’GATCCCCTCCACTATGTGGATAATAATTCAAGAGATTATTATCCACATAGTGGATTTTTGGAAA 3’5’AGCTTTTCCAAAAATCCACTATGTGGATAATAATCTCTTGAATTATTA...
【专利技术属性】
技术研发人员：许丽艳，谢剑君，李恩民，
申请(专利权)人：汕头大学医学院，
类型：发明
国别省市：44[中国|广东]
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