长效沉默食管癌细胞ＨＩＦ－１α基因的２１ＳｈＲＮＡ荧光表达载体的构建制造技术

本发明专利技术公开了一种长效沉默食管癌细胞ＨＩＦ－１α基因的２１ＳｈＲＮＡ荧光表达载体的构建，从ＮＣＢＩ获取ＨＩＦ－１α基因ＩＤ?ＮＭ＿００１５３０．３，软件预测设计２１个寡核苷酸ｓｉＲＮＡ干扰序列，依据质粒插入位点和接头结构设计编码ｓｈＲＮＡ的ＤＮＡ序列，并连接ｐＥＺｓｉＲＮＡ６．１载体，得到长效沉默ＨＩＦ－１α基因的ｐＥＺｓｉＲＮＡ６．１ｈｉｆ－１α重组质粒。本发明专利技术利用ｓｉＲＮＡ原理，设计ＨＩＦ－１α干扰序列，构建ｓｈＲＮＡ长效干扰荧光表达载体，经细胞转染并筛选鉴定后能够得到长效沉默ＨＩＦ－１α蛋白表达的稳定细胞系，为以ＨＩＦ－１α为靶标的新药开发和基因治疗提供了新材料。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种长效沉默食管癌细胞ＨＩＦ－１α基因的２１ＳｈＲＮＡ荧光表达载体的构建，其特征在于：包括下述步骤：　　（１）从ＮＣＢＩ获取ＮＭ＿００１５３０．３，利用ＷＨＩＴＥＨＯＵＳＥ软件进行预测分析由２１个核苷酸组成的干扰序列，ＧＣ含量控制在３０％－５０％；同时利用ｓｉＤｉｒｅｃｔ在线设计软件，将已获得的ｍＲＮＡ序列全长输入待预测序列框，选择设计方针为雷诺方程，ＧＣ含量控制在３０％－５０％，运行远程预测程序，获得预测结果；　　（２）以ＮＣＢＩ的Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｂｌａｓｔ对各个预测的核苷酸序列进行比对，设计得到一条２１核苷酸的ＨＩＦ－１α的干扰序列，既正义链为：５’ＣＡＧＣＡＧＡＣＴＣＡＡＡＴＡＣＡＡＧＡＡ３’的寡核苷酸干扰序列，ＧＣ比为３６．８％；　　（３）依据质粒的插入位点和接头结构设计编码ｓｈＲＮＡ的单链ＤＮＡｏｌｉｇｏｓ，在正义链序列５’加入ＧＡＴＣＣＣ，中部加入ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ结构的ｌｏｏｐ环，３’端加ＴＴＴＴＴＧＧＡＴ；反义链设计５’加入ＡＧＣＴＡＴＣＣＡＡＡＡＡ，中部加入ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ结构的ｌｏｏｐ环，３’端加ＧＧ，最终连接入载体的编码ｓｈＲＮＡ的ＤＮＡ序列为：正向：ＧＡＴＣＣＣＣＡＧＣＡＧＡＣＴＣＡＡＡＴＡＣＡＡＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＴＣＴＴＧＴＡＴＴＴＧＡＧＴＣＴＧＣＴＧＴＴＴＴＴＧＧＡＴ，反向：ＡＧＣＴＡＴＣＣＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡＧＡＣＴＣＡＡＡＴＡＣＡＡＧＡＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＴＣＴＴＧＴＡＴＴＴＧＡＧＴＣＴＧＣＴＧＧＧ；　　（４）单链ＤＮＡ　ｏｌｉｇｏ退火生成双链ｏｌｉｇｏ，双链ｏｌｉｇｏ连接ｐＥＺｓｉＲＮＡ６．１载体，ＢａｍＨＩ和Ｈｉｎｄ　Ⅲ对载体进行双酶切，按照２０μｌ反应体系进行连接反应，１６℃连接过夜，冰浴并转化感受态ＤＨ５α，用含１００ｍｇ／ｌ氨苄霉素琼脂平板筛选阳性克隆，提取得到ｐＥＺｓｉＲＮＡ６．１ｈｉｆ－１α重组质粒。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：汲振余，康巧珍，郭欢，孙蕾，赵立群，杨观瑞，阎红霞，张亚冰，张聚真，杨小静，裘一兵，
申请(专利权)人：河南省医药科学研究院，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]