本发明专利技术的课题是提供间皮瘤诊断剂等，与目前为止报导的间皮瘤诊断试剂盒等相比，其能够有效地识别健康正常人与间皮瘤患者，从有接触石棉经历的人中鉴别出间皮瘤患者，识别肺癌等其它疾病的患者与间皮瘤患者，等等。本发明专利技术的间皮瘤诊断剂以下述抗体为有效成分，所述抗体识别将３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／间皮素在血液中或血清中室温下放置３小时以上而产生的片段的Ｎ端侧片段。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及可用于间皮瘤早期诊断的间皮瘤诊断剂、间皮瘤诊断试剂 盒和间皮瘤诊断方法。
技术介绍
近年来，具有接触石棉经历的人高频率地发生间皮瘤已经发展成社会 问题。间皮瘤有恶性的也有良性的，多数恶性间皮瘤患者具有石棉接触经历，从接触石棉起经过30-35年的长潜伏期而发生恶性间皮瘤。因此，不能 否认今后存在间皮瘤患者增加的可能性。此外，间皮瘤是难以早期发现的疾病，现在通过使用MRI、 CT等的方 法来诊断间皮瘤，但这些方法难以进行早期诊断，存在的问题是很多情 况下，诊断出间皮瘤时疾病已经处于进展之中。仅仅考虑到这种情况，也 迫切希望本疾病的早期诊断，但是目前为止还没有发现有效的早期诊断标 志物。目前为止，已经发现的间皮瘤相关的标志物包括被称作Erc、 MPF和 间皮素(Mesothelin)的蛋白。这其中的来龙去脉如下。首先，1994年Yamaguchi等报导从人胰脏癌细胞HPC-Y5上清纯化 出了称作MPF (Megakaryocyte potentiating factor,巨核细月包强化因子)的蛋白 (文献1),而且1995年Kojima等报导从人胰脏癌细胞HPC-Y5的cDNA 克隆化了 MPF(文献2)。其后，Chang等制作了与在间皮细胞、卵巢癌和间皮瘤的表面表达的 40kDa表位反应的单克隆抗体Kl,在4吏用该抗体寻找编码其抗原蛋白的基 因时，分离出了具有编码69kDa蛋白的1884bp开放阅读框(open reading frame)的基因。然后Chang等又阐明该69kDa蛋白为上述40kDa蛋白的 前体，该69kDa蛋白因磷脂酰肌醇特异性磷脂酶(PI-PL)的作用而被切断， 从而在细胞表面表达40KDa蛋白。这以后，Chang等将该69kDa蛋白命名 为间皮素(文献3)，接下来又阐明上述的MPF与间皮素是同一蛋白。另一方面，Scholler等免疫卵巢癌细胞制作了单克隆抗体OV569,并对 单克隆抗体OV569所识別的蛋白进行了检索，结果发现该蛋白具有与间皮 素的膜结合区域相同的序列，其分子量为42-45kDa，并将其称作可溶性间 皮素(Soluble member of mesothelin)。研究表明该蛋白在中途发生了框移突 变，其结果是变成C末端区域的GPI锚定部分不同的序列，因此变为可溶 性。而且，使用与OV569识别相同蛋白的另一单克隆抗体4H3构建了夹心 EIA(Sandwich EIA)测定系统，发现对卵巢癌患者血清的测定结果显示出比 健康正常人高的上述蛋白的值(文献4)。而且，Robinson等报导使用该测 定系统对间皮瘤患者进行了测定，结果显示出比健康正常人高的上述蛋白 的值(文献5)。作为本专利技术人的樋野等通过长年对疾病模型动物进行研究，搜寻了肾 癌发病模型Eker大鼠的原因基因。其结果，发现了与正常肾组织相比、在 Eker大鼠肾癌来源的细胞系中显示高表达的基因，并将其中的l个命名为 Erc。而且，对大鼠Erc的人同源物进行搜寻的结果表明人的MPF与大鼠 Erc具有56.1%的同源性(文献6、 7)。根据以上情况可以认为(l)人Erc、 MPF和间皮素(以下将它们称为 "Erc/MPF/间皮素")是全长622氨基酸的糖蛋白，其第290-295位氨基酸具有 RPRFRR序列，因而受到费林(Furin)样蛋白酶的加工，裂解为31 kDa和40kDa 的片段；(2)40kDa片段的C末端侧区域因其C末端包含GPI锚定区域而以 与细胞膜结合的形式保留下来，而N末端侧的31kDa片段以可溶性蛋白的 形式分泌(以下将其称作"31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素，，)；(3)此外，结合在 细胞膜上的40kDa片段的C末端侧也可因磷脂酰肌醇-特异性磷脂酶 C(phosphatidiylinositol-specific phospholipase C: PI-PLC)处理而从细月包中释 放出来；等等。有报导称这些通过不同方法鉴定出的Erc/MPF/间皮素不仅在正常间 皮细胞和间皮瘤中强表达，而且还存在于间皮瘤患者的血液中。然而，凭 借这些认识还无法明确在间皮瘤中分泌什么类型的Erc/MPF/间皮素。目前为止，本专利技术人等提示上述31kDa分泌型Erc/MPF/间皮素在间皮 瘤患者的血清中以高浓度存在，并且报导了据此可以诊断间皮瘤(文献8)。 但是，该报导不能对目的蛋白在患者试样中以怎样的状态存在进行可视化。 此外，该报导中是使用识别3 lkDa分泌型Erc/MPF/间皮素的C末端区域的抗体来进行测定，因而仅能测定完整地保持了全长的31kDa分泌型 Erc/MPF/间皮素，而不能测定C末端因某种作用分解缺损而产生的片段。此外，在本专利技术人等的报导之后，还有人报导通过检测31kDa分泌 型Erc/MPF/间皮素，能够诊断间皮瘤(文献9),但该报导中ELISA系统测定 的MPF的测定值并非以绝对值表示。此外，在该报导中，虽然实际测定了 间皮瘤患者和健康正常人的血清，但其结果并非以MPF的绝对值表示，而 只是简单地以吸光度表示，这样就无法对不同试验的值进行比较。推测其 中的原因是无法将标准物质与血液中的MPF进行换算。此外，作为其中的 原因，还可以推测是抗体的特异性、亲和性在重组体与血液中的天然型之 间不同。而且，在该报导中虽然对所得数个抗体之间识别表位的差异进行 了研究，但实际上仅考察了各自的表位是否不同，而并未明确各抗体的识 别表位的位置。由此可以断定现有技术并不适用于实用性诊断。非专利文献1 Yamaguchi N， HattoriK, Oh-edaM, KojimaT, Imai N,Ochi N. A novelcytokine exhibiting megakaryocyte potentiating activity from a human pancreatictumor cell line HPC-Y5,, J Biol Chem.269: 805-808, 1994.PMID: 8288629非专利文献2Kojima, T.; Oh-eda, M.; Hattori, K.; Taniguchi， Y.; Tamura， M.; Ochi, N.; Yamaguchi, N. : Molecular cloning and expression of megakaryocyte potentiating factor cDNA., J. Biol. Chem. 270: 21984-21990，1995. PubMed ID : 7665620非专利文献3Chang, K; Pastan, I.: Molecular cloning of mesothelin, adifferentiation antigen present on mesothelium, mesotheliomas, and o曹iancancers., Proc. Nat. Acad. Sci. 93:136-140,1996. PubMed ID : 8552591非专利文献4 Scholler, N;本文档来自技高网...
【技术保护点】
识别３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／间皮素缺失其Ｃ末端的氨基酸而得到的肽的抗体。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：樋野兴夫，清藤勉，
申请(专利权)人：株式会社免疫生物研究所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]
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