具有重叠开放阅读框的基因在昆虫细胞中的表达及其方法和组合物技术

本发明专利技术公开了用于在昆虫细胞中表达由包含重叠开放阅读框（ＯＲＦ）的基因编码的多种多肽的核酸盒。所述核酸盒按照５’至３’顺序包含：ａ）第一昆虫细胞可操作启动子；ｂ）包含所述基因的第一ＯＲＦ的基因的５’部分；ｃ）包含第二昆虫细胞可操作启动子的内含子；以及ｄ）包含至少一种另外的ＯＲＦ的基因的３’部分。本发明专利技术还公开了包含所述核酸盒的载体和昆虫细胞，以及使用所述核酸盒在昆虫细胞中制备重组腺病毒相关病毒的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2006年8月24日提交的美国临时专利申请60/839,761的优先权，其通过引用完整并入本申请。
技术介绍
已知哺乳动物基因组中存在包含重叠开放阅读框(ORF)的基因。在某些情况中，这些基因包含具有支持ORF转录的启动子的内含子(参见，例如，Reisman，D.等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)855146-5150，1988；Bennett，V.D.等，J.Biol.Chem.(《生物化学杂志》)2652223-2230，1990)。然而，编码多种ORF且在内含子中包含启动子的天然存在或人工的昆虫基因尚无报道。 细小病毒科(Parvoviridae)包括单链DNA动物病毒家族。细小病毒科分为两种亚科感染脊椎动物的细小病毒亚科(Parvovirinae)和感染昆虫的浓核病毒亚科(Densovirinae)。细小病毒亚科(本文中其成员被称为细小病毒)包括依赖病毒属(Dependovirus)，依赖病毒属成员的独特之处在于，对于细胞培养物中的生产性感染，在大多数条件下这些病毒需要与辅助病毒，诸如腺病毒或疱疹病毒共感染。依赖病毒属包括正常情况下感染人类和灵长类动物的腺病毒相关病毒(AAV)(例如，血清型1、2、3、3A、3B、4、5、6、7、8、9、10以及11)和感染其他温血动物的有关病毒(例如，牛、犬、马以及羊的腺病毒相关病毒)。细小病毒和细小病毒科的其他成员描述于Kenneth I.Berns，“ParvoviridaeThe Viruses and TheirReplication(细小病毒科病毒及其复制)，”FIELDS VIROLOGY(《费氏病毒学》)第69章(第3版，1996)，和Choi等，Curr Gene Ther.(《现代基因治疗》)6月；5(3)299-310(2005)的最新综述文章。 AAV基因组是线性单链DNA分子，具有少于约5,000个核苷酸(nt)长度。末端反向重复序列(ITR)侧邻非结构复制蛋白(Rep)和结构蛋白(VP)的单一核苷酸编码序列。ITR自我互补并且其构成使得能够形成能量稳定的分子内双链T形发夹。这些发夹结构作为病毒DNA复制的起始点发挥作用。Rep基因编码Rep蛋白Rep78、Rep68、Rep52以及Rep40。Rep78及其剪接变体Rep68从自p5启动子转录的mRNA翻译而来。Rep52及其剪接变体Rep40从自p19启动子转录的mRNA翻译而来。Cap基因编码VP蛋白VP1、VP2以及VP3。这些蛋白形成衣壳，由Cap基因自p40启动子转录产生的两种剪接的mRNA合成。其中一种信使RNA被翻译成VP1，而另一种转录物编码VP2和VP3。VP2的天然存在的起始密码子是劣用的ACG，其导致核糖体扫描至VP3起始密码子(AUG)。VP1转录物的两个剪接受体位点的交替使用和VP2的ACG起始密码子的劣用被认为对AAV2感染的哺乳动物细胞中VP1、VP2以及VP3的化学计量发挥作用，并反映衣壳中的蛋白比例1:1:10。Urabe，M.等，Hum.Gene Ther.(《人类基因治疗》)131935-1943，2002。 已知AAV的ITR作为复制起始点，即在复制中具有“顺式(cis)”作用的位点发挥作用，并作为反式作用复制蛋白(例如，Rep78或Rep68)的识别位点发挥作用，所述反式作用复制蛋白识别回文序列和回文序列内部的特定序列。ITR序列的对称性的一个例外是ITR的“D”区。它是单一的(在一种ITR中不具有互补性)。单链DNA的切口产生于A和D区之间的连接处。它是新的DNA合成起始的区域。D区通常位于回文序列的一侧，并提供核酸复制步骤的方向性。哺乳动物细胞中的AAV复制通常具有两种ITR序列。 在哺乳动物细胞中，AAV的四种Rep蛋白由来自单阅读框的多种转录物编码。图位5和19的启动子调控Rep ORF的转录。Rep78和Rep68从p5启动子表达，且相互间的3’剪接不同。Rep68是Rep78的羧基截短形式，但是由于在剪接受体位点存在移码，导致Rep68含有7个特有的残基。Rep52和Rep40转录物由p19启动子表达，并与较大的Rep多肽位于框内。较小的Rep多肽相互之间以Rep78和Rep68的相同方式通过剪接事件而不同。Rep的功能结构域是氨基末端--DNA结合--DNA切割--ATP酶--螺旋酶--核定位信号--修饰的锌指--COOH。DNA结合和DNA切割的功能仅存在于自p5转录的Rep蛋白。 AAV经作为一种连续分子的双链DNA中间体(两条链通过ITR共价连接)复制。p5 Rep蛋白能够识别ITR内的基序，切割双链的一条链，并通过切口5’侧的酪氨酸基胸腺嘧啶核苷磷酸二酯键共价连接。Rep的螺旋酶活性被认为对新产生的5’末端的解旋发挥作用，且细胞聚合酶复合物延伸凹缺的3’末端而产生双链钝末端复制中间体。较小的Rep蛋白保留ATP依赖的DNA螺旋酶活性，并参与单链病毒基因组的衣壳化。Rep52和Rep40与所形成的衣壳相关，并且据推测，解旋双链复制中间体。 最近几年，AAV由于其有效感染非分裂细胞和分裂细胞、整合入人类基因组的单个染色体位点并对人类具有较低的致病危险的能力，而成为基因治疗的优选病毒载体。鉴于这些优点，重组腺病毒相关病毒(rAAV)目前用于乙型血友病、恶性黑色素瘤、囊性纤维化病以及其他疾病的基因治疗临床试验。 用于在昆虫细胞中制备AAV的AAV序列可衍生自任何AAV血清型的基因组。通常，AAV血清型具有在氨基酸和核酸水平的显著序列同一性的基因组序列，提供实质上相同的一系列遗传功能，产生物理和功能上基本相同的病毒体，并通过实际上相同的机制复制和装配。对于AAV血清型的基因组序列和基因组相似性的讨论，参见，例如，GenBank登录号U89790；GenBank登录号J01901；GenBank登录号AF043303；GenBank登录号AF085716；Chiorini等，J.Vir.(《病毒学杂志》)716823-33(1997)；Srivastava等，《病毒学杂志》45555-64(1983)；Chiorini等，《病毒学杂志》731309-1319(1999)；Rutledge等，《病毒学杂志》72309-319(1998)；以及Wu等，《病毒学杂志》748635-47(2000)。 使用当前的哺乳动物细胞制备系统进行大规模rAAV制备如果不是完全不可行，则其所涉及的困难也是显著的。例如，对于某些临床研究来说，可能需要多于1015个颗粒的rAAV。为了在哺乳动物细胞系，诸如人类293细胞中制备该数量的rAAV颗粒，需要转染和培养约1011个细胞，相当于5,000个172cm2的细胞培养瓶。还存在下述可能性即在哺乳动物细胞培养物中制备的要用于临床用途的载体将受到哺乳动物细胞中存在的不想要的(或许是病原性的)物质的污染。 Kotin等的美国专利第6,723,551 B2号和Urabe等，《病毒学杂志》801874-1885，2006公开了在昆虫细胞中制备rAAV载体的方法。在这些公开内容中，构建了杆状病毒载体，所述载体包含以回文序列头至尾排列编码本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于在昆虫细胞中表达由包含重叠开放阅读框（ＯＲＦ）的基因编码的多种多肽的核酸盒，所述核酸盒按照５’至３’顺序包含：　ａ）第一昆虫细胞可操作启动子；　ｂ）包含所述基因的第一ＯＲＦ的基因的５’部分；　ｃ）包含第二昆虫细胞可 操作启动子的内含子；以及　ｄ）包含至少一种另外的ＯＲＦ的基因的３’部分，　其中，所述第一昆虫可操作启动子与所述第一ＯＲＦ可操作地连接；所述第一ＯＲＦ包含第一翻译起始密码子；所述第二昆虫细胞可操作启动子与所述至少一种另外的ＯＲＦ可 操作地连接，所述至少一种另外的ＯＲＦ包含至少一种另外的翻译起始密码子，并且其中，ａ）、ｂ）、ｃ）以及ｄ）中的至少一者与ａ）、ｂ）、ｃ）以及ｄ）中的至少另一者是异源的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2006-8-24 60/839,7611.一种用于在昆虫细胞中表达由包含重叠开放阅读框(ORF)的基因编码的多种多肽的核酸盒，所述核酸盒按照5’至3’顺序包含a)第一昆虫细胞可操作启动子；b)包含所述基因的第一ORF的基因的5’部分；c)包含第二昆虫细胞可操作启动子的内含子；以及d)包含至少一种另外的ORF的基因的3’部分，其中，所述第一昆虫可操作启动子与所述第一ORF可操作地连接；所述第一ORF包含第一翻译起始密码子；所述第二昆虫细胞可操作启动子与所述至少一种另外的ORF可操作地连接，所述至少一种另外的ORF包含至少一种另外的翻译起始密码子，并且其中，a)、b)、c)以及d)中的至少一者与a)、b)、c)以及d)中的至少另一者是异源的。2.根据权利要求1所述的核酸盒，其还包含e)位于d)的3’的多聚腺苷酸化信号。3.根据权利要求1所述的核酸盒，其中，所述第一昆虫细胞可操作启动子和所述第二昆虫细胞可操作启动子中的每一个独立地选自由p10启动子和polh启动子组成的组。4.根据权利要求1所述的核酸盒，其中，所述包含重叠ORF的基因选自由腺病毒相关病毒(AAV)的Rep基因和AAV的Cap基因组成的组。5.根据权利要求4所述的核酸盒，其中，所述第一ORF是Rep78/68 ORF，所述至少一种另外的ORF是Rep 52/40 ORF。6.根据权利要求5所述的核酸盒，其中，所述第一启动子是p10启动子，所述第二启动子是polh启动子。7.根据权利要求4所述的核酸盒，其中，所述第一ORF是VP1ORF，所述至少一种另外的ORF是VP2/VP3 ORF。8.根据权利要求7所述的核酸盒，其中，所述第一启动子是第一polh启动子，所述第二启动子是第二polh启动子。9.一种包含权利要求1所述的核酸盒的载体。10.根据权利要求9所述的载体，其中，所述载体选自由质粒、病毒及其组合组成的组。11.一种包含权利要求1所述的核酸盒的体外昆虫细胞。12.一种包含权利要求1所述的第一核酸盒和权利要求1所述的第二核酸盒的体外昆虫细胞，其中，所述第一核酸盒包含含有Rep78/68 ORF和Rep 52/40 ORF的Rep基因，所述第二核酸盒包含含有VP1 ORF和VP2/VP3 ORF的Cap基因。13.根据权利要求12所述的昆虫细胞，其还包含另外的核酸盒，所述另外的核酸盒按照5’至3’顺序包含腺病毒相关病毒的第一末端反向重复序列(ITR)；哺乳动物细胞可操作启动子；转基因；多聚腺苷酸化信号；以及AAV的第二ITR。14.根据权利要求13所述的昆虫细胞，其中，所述转基因为编码多肽的报告基因，所述多肽选自由氯霉素乙酰转移酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、海肾荧光素酶、萤火虫荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)以及碱性磷酸酶组成的组。15.根据权利要求13所述的昆虫细胞，其中，所述转基因包含编码多肽的ORF，所述多肽选自由多肽激素、干扰素、血液凝固因子、疫苗以及促红细胞生成素组成的组。16.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海峰，
申请(专利权)人：威洛克有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]