本发明专利技术公开了一种昆虫干标本基因组DNA提取方法，为改进的饱和NaCl法，包括以下步骤：(1)昆虫干标本的预处理(2)研磨预处理的材料至粉状，将研磨产物转入1.5mlEP管，(3)加入溶液1溶解，除RNA，(4)加入消化液2消化，离心，转移上清至另一EP管，(5)蛋白质沉淀，(6)洗涤。本发明专利技术的方法适用于膜翅目、蜻蜒目、直翅目、鞘翅目等多种昆虫干标本不同部位DNA提取，提取效率高，所提DNA质量和纯度可供昆虫分子系统进化分析，为研究、探索最合适部位、最小量材料、最小损坏标本提取昆虫干标本基因组DNA提供了基础方法，操作简单易行，便于实验室开展。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种昆虫干标本基因组DNA提取方法，为改进的饱和NaCl法，包括以下步骤：(1)昆虫干标本的预处理(2)研磨预处理的材料至粉状，将研磨产物转入1.5mlEP管，(3)加入溶液1溶解，除RNA，(4)加入消化液2消化，离心，转移上清至另一EP管，(5)蛋白质沉淀，(6)洗涤。本专利技术的方法适用于膜翅目、蜻蜒目、直翅目、鞘翅目等多种昆虫干标本不同部位DNA提取，提取效率高，所提DNA质量和纯度可供昆虫分子系统进化分析，为研究、探索最合适部位、最小量材料、最小损坏标本提取昆虫干标本基因组DNA提供了基础方法，操作简单易行，便于实验室开展。【专利说明】一种昆虫干标本基因组提取方法及其应用
本专利技术涉及分子生物
，尤其涉及一种昆虫标本基因组DNA提取方法。
技术介绍
DNA是遗传信息的载体，是分子生物学研究的主要对象。由于DNA序列中含有丰富的生物学信息，记载了生物进化的历史。在活体细胞中，DNA存在完整的修复机制，使DNA完整无损。但DNA化学性质极不稳定，在干标本中可以通过水解或氧化作用自发地降解。在标本馆中的干标本是一个巨大的遗传基因信息库，现代分子生物学随机扩增多态DNA(RAPD)技术、限制性片段长度多态性(RFLP)技术DNA指纹技术、以及对12srRNA，16srRNA, 18SrRNA,ND5等序列的测定，已经广泛应用于昆虫分类的研究。应用DNA序列研究生物的系统发育和进化规律成为当前分子系统学研究的热点。而这些技术的应用，首先最基本的问题是基因组DNA的提取.技术的迅速发展使我们得以在分子水平上揭示和利用这个巨大的遗传信息库变得可能，这为生物分类、系统发育、生态和进化提供了新的科学依据和发展机会。许多研究者介绍的基因组DNA的提取方法中所采用的材料基本上是新鲜样品或超低温冷冻标本(Blin&Stafford, 1976 ；Bowtell, 1987 ；Gross-Bellardd el al., 1972 ；Kupiec el al.，1987 ;王文和施立明，1993)，但是分子系统发育和进化研究中经常出现所研究的类群，特别是稀有类群难以得到新鲜材料的问题，因此往往需要利用自然博物馆或标本馆的干标本提取基因组DNA，但干标本保存时间越长基因组DNA的降解也越严重。因此，如何从干标本中提取基因组DNA的方法对系统发育和进化研究至关重要。目前，国内外提取昆虫干标本的主要方法有:CTAB法，SDS法，蛋白酶K法，饱和NaCl法，酚仿抽提法等。酚仿抽提法是提取核酸的经典方法，主要原理是利用核酸、蛋白等杂质在水相和有机相中溶解度不同而重新分配，实质上为使用蛋白酶K消化后用酚/氯仿去除蛋白质的抽提方法。CTAB法为Murray和Thompson专利技术的,其原理为CTAB是一种离子型去垢剂，能使核酸和酸性多糖从低离子强度的溶液中沉淀出来，同时，蛋白质和中性多糖等杂质留在溶液中。CTAB法常用于新鲜植物组织的DNA提取。SDS法由Dellaporta等专利技术，利用SDS-Tris-Cl-EDTA等直接裂解细胞释放DNA，用酚/氯仿反复抽提后乙醇沉淀出DNA。传统DNA提取方法，如SDS法、CTAB法、蛋白酶K法经不少专家学者改进后，仅可提取出某个目或某些昆虫的干标本DNA。蛋白酶K法中蛋白酶K的用量与最终DNA的得率成正比(Kosel&Grae2ber, 1994 ;Diaz2Cano&Brady, 1997),在消化过程中加入还原剂(巯基乙醇或二硫苏糖醇DDT)似乎可以提高DNA的得率(Paabo，1989)。一般用乙醇沉淀DNA。然而，Kosel&Grae2ber (1994)认为用这种方法提取标本DNA，PCR抑制剂会与DNA —起被抽提出来，影响后面的PCR反应。刘波等(1999)用CTAB法分别对稻蝗(Oxya)的干标本和酒精浸泡标本的DNA进行提取并获得了满意结果。张晟铭等利用SDS法提取了鞘翅目小蠹科的干标本DNA。由此可知:上述各种昆虫干标本DNA提取方法适用范围极其狭窄，仅仅适合于某一种或某一昆虫目干标本基因组DNA的提取，对其他类别的昆虫干标本DNA的提取并未取得良好的效果，而且酚仿抽提法提取DNA含有较多杂质，对于微量组织和多年保存的干标本，此3种方法提取效果较差，不能进行特异性PCR扩增等后续研究。国内外以昆虫干标本基因组DNA为研究的仅仅集中在膜翅目、鳞翅目、鞘翅目等少数几个目，而且昆虫干标本DNA的提取方法各自不同。然而，由于昆虫种类之多，体系庞大，发育阶段存在差异，未涉及研究的昆虫仍不能快速有效地确定提取方法，使得昆虫标本馆中的所蕴藏的巨大的遗传基因信息库不能得以利用，严重阻碍了昆虫的分子系统进化的研究进程。昆虫分子系统学研究领域迫切需要一种可适用于多个类目昆虫干标本的基因组DNA提取方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种适用于多个目昆虫的干标本基因组DNA提取方法。为实现专利技术目的，本专利技术采取如下技术方案:一种昆虫干标本基因组DNA提取方法，为改进的饱和NaCl法，包括以下步骤(I)昆虫干标本样品的获取和预处理，研磨预处理材料至粉状，将研磨产物转入Ep管，(2)加入溶液(I)溶解，除RNA，(3加入消化液(2)消化，离心，转移上清至另一 Ep管，(4)蛋白质沉淀，(5)洗涤，(6)干燥，(7)TE溶解，-2(rC保存备用。步骤(1)所述的昆虫干标本样品的用于提取基因组DNA，获取方法为:从昆虫标本胸部和足部、头部剪取肌肉0.03g，于STE缓冲液(0.1mmol/LNaCI, pH8.010mmol/L Trisbuffer, pH8.0lmmol/L EDTA, dsH20)中室温浸泡预处理5h，取出后在消毒的滤纸上干燥。步骤(1)所述的研磨放入Ep管中采用灭菌的玻棒研在Ep管中磨碎所述研磨得到的粉末用含0.4ml TE溶解悬浮。步骤⑵所述溶液I用量为300~400 μ 1，所述溶液(I)为包含0.1 %的RNase的0.4ml TE，步骤(3)所述去除RNA的温度为35~37°C，时间为45~60min，室温离心12000rpmlmino步骤(3)所述消化液I用量为300~400 μ 1，所述消化液⑵包括成为:2~8%SDS’ 100~300 μ g/ml的蛋白酶K ，所述消化液⑵的PH为8.0,步骤(4)所述消化温度为25~37°C，时间为，16~30h。步骤(4)所述蛋白质沉淀包括:I)加1/4体积饱和NaCl,润旋s或静置5~8min, 12000r/min离心20min,将上清转移到另一支离心管，2)加等体积的氯仿,充分混匀后离心12000r/min离心15min,3)吸取水相至另一新管内，加入1/10体积的3M NaAc (pH5.2)混匀后，加入等体积的异丙醇并轻轻混匀，12000rpm离心5min离心,去除上清液。步骤(5)所述洗涤是加入70%乙醇0.6ml，可见乳白色絮状DNA团块，充分洗涤DNA沉淀。步骤(6)所述干燥选自空气中自然干燥或置37 °C温箱中干燥3min。步骤(7)所述TE溶解为加入TE (pH8.0) 30~45 μ I溶解DNA。所述的0.1%是指100本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种昆虫干标本基因组DNA提取方法，为改进的饱和NaCl法，包括以下步骤：(1)昆虫干标本样品的获取和预处理(2)加入溶液(1)溶解，除RNA，(3)加入消化液(2)消化，(4)蛋白质沉淀，(5)洗涤，(6)干燥，(7)TE溶解，?20℃保存备用；其特征在于，步骤(1)所述的获取待提取用于提取DNA的材料的方法为：所述昆虫干标本样品为用于提取DNA的材料的部位，包括足、胸、头、，重量为0.03g。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：南小宁，伏正，魏琮，冯继广，周浪，赵雅琼，郭新荣，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：
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