阶段Ⅱ解毒和抗氧化剂活性制造技术

提供了增强阶段ＩＩ解毒或抗氧化剂酶转录的Ｎｒｆ２（ＳＫＮ－１）激活的方法和组合物（包含植物提取物（例如柳提取物）或其活性级分），以及用于鉴定提高那些酶的Ｎｒｆ２调节的别的化合物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及柳、茶、及其提取物的抗氧化剂和解毒功能增强作用。
技术介绍
活体不断被暴露于能引起不良效果的各种物质。此类物质包括例如重金属、某些 食品添加剂、紫外线、和烟草。在这些物质对活体起作用时，产生称为自由基的反应性氧类 别(reactive oxygen species)。活体进一步暴露于它作为某些生理学过程的副产物生成 自身的氧化应激。认为氧化应激为许多状况诸如癌症、常见的疾病、和衰老症状的风险因素 之一。活体使用清除自由基和使毒性物质解毒的机制(在本文中称为宿主防御机制)来处 理此类氧化应激。在这种介导(mediation)/解毒机制受到损害时(例如由于正常的衰老 过程)，防御机制不能完全介导这些化学物，并使这些化学物解毒，即一种有时能导致疾病 发作的过程。为了解决此问题，已经尝试了用于阻止疾病的形成或行进的方法，包括采取或应 用具有抗氧化剂效果的物质(例如包含维生素C和/或E的组合物)。这些方法是有效的； 不过，通常需要消化大量的抗氧化物质，以便产生临床上显著的效果。另一方面，一旦得到增强，上文所提及的宿主防御机制能有效地除去氧化应激，并 且因此预期比采用抗氧化物质更有用。“Nrf2”(即一种细胞核内转录因子)作为调节宿主 防御机制的一种至关重要的蛋白质吸引了众多兴趣。在细胞暴露于氧化应激或毒性物质 时，细胞胞质中存在的Nrf2分子被输入细胞核中，在那里它们结合称为抗氧化剂应答元件 的基因调节区(参见例如 Nguyen 等，Ann. Rev. Pharm. Toxicol.，2003，43 :233_60)，而且诱 导称为阶段II解毒酶(phase II detoxification enzyme)的氧化应激响应酶(其存在于 称为抗氧化剂应答元件的序列下游)的表达。已知缺乏Nrf2基因的动物具有受损的宿主 防御机制。如此Nrf2在针对氧化应激和毒性物质的宿主防御机制中发挥至关重要的作用。专利技术概述本专利技术人已经发现了，某些植物提取物中的物质活化SKN_1/Nrf2，而且强烈诱导 阶段II解毒酶(P2D)基因的表达，降低8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-0HdG)的水平，并提高叉 头框(forkhead box)01 (F0X01)基因表达的水平。如此，一方面，本专利技术的特征为用于增强P2D和抗氧化剂酶活性的方法和组合物， 例如包含植物提取物(例如柳、绿茶、胡萝卜、或花椰菜(broccoli)的提取物)和/或其活 性级分的组合物。另一方面，本专利技术的特征为鉴定活化SKN-1/Nrf2，因此增强P2D基因表达 的物质的方法。如本文中所使用的，“活性级分”指与非分级提取物相比每份重量具有升高 的活性的提取物级分。一方面，本专利技术提供了包含植物提取物(例如柳、绿茶、胡萝卜、或花椰菜的提取物)或其活性级分的组合物，其中所述组合物提高阶段II解毒酶(P2D)基因和抗氧化剂酶 基因之一或两者在细胞中的表达。例如，组合物能提高选自谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰 物亚基(GCLM)和谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)的P2D基因；和/或抗氧化剂 基因(例如超氧化物歧化酶1(S0D1))的表达。在一些实施方案中，组合物还提高F0X01的 表达和/或降低8-羟基-2’ -脱氧鸟苷(8-0HdG)的水平。在一些实施方案中，将所述组合物配制用于口服，而且还可以包含一种或多种口 服可接受载体和添加剂。在一些实施方案中，将组合物配制用于表面(topical)施用，而且 还可以包含一种或多种表面可接受载体和添加剂。在又一方面，本专利技术提供了用于提高柳提取物的阶段II解毒酶(P2D)和/或抗氧 化剂酶增强活性的方法。该方法包括提供具有第一水平的P2D增强活性的柳提取物；对所 述提取物分级，以便获得两种或更多种级分；选择具有0. 5或更大的Rf值的级分；测定所 述级分的P2D增强活性；并且若级分具有比P2D增强活性的第一水平高的P2D增强活性水 平，则选择该级分。在一些实施方案中，对所述提取物分级包括使用一种或多种选自下组的方法柱 层析、液液分级、和固液分级。在又一方面，本专利技术提供了鉴定提高阶段II解毒酶(P2D)或抗氧化剂基因在细胞 中表达的化合物的方法。该方法包括提供表达(i)P2D或抗氧化剂基因或(ii)包含P2D或 抗氧化剂基因启动子(例如P2D基因启动子的Nrf2结合序列)的报告物构建体的细胞；提 供植物提取物的级分；使所述细胞与所述级分接触；并检测所述级分对所述P2D或抗氧化 剂基因或报告物构建体表达的影响。提高所述P2D或抗氧化剂基因或报告物构建体表达的 级分包含提高阶段II解毒酶(P2D)和/或抗氧化剂基因在细胞中的表达的化合物。在一些实施方案中，该方法还包括选择提高所述P2D或抗氧化剂基因或报告物构 建体表达的级分，并进一步分开所述级分，以便生成两种或更多种亚级分；提供表达P2D或 抗氧化剂基因或包含P2D或抗氧化剂基因启动子(例如P2D基因启动子的Nrf2结合序列) 的报告物构建体的细胞；使所述细胞与所述亚级分接触；并检测所述亚级分对所述P2D或 抗氧化剂基因或报告物构建体表达的影响，其中提高所述P2D或抗氧化剂基因或报告物构 建体表达的亚级分包含提高阶段II解毒酶(P2D)或抗氧化剂基因在细胞中表达的化合物。 提高P2D或抗氧化剂基因或报告物构建体表达的亚级分包含提高阶段II解毒酶(P2D)和 /或抗氧化剂基因在细胞中表达的化合物。任选地，可以重复这些步骤，直至获得纯化的化 合物，或者使用标准的分开-合并(split-pool)方法来鉴定和获得纯化的化合物。 在一些实施方案中，该方法还包括将所述纯化的化合物配制用于口服或表面施 用。在一些实施方案中，这些方法中所使用的细胞是培养细胞、外周血单个核细胞 (PBMC)、或秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中的细胞(例如ASI细胞)。在一些实施方案中，所述植物提取物是柳提取物。在一些实施方案中，所述P2D基因选自下组谷氨酸_半胱氨酸连接酶修饰物亚基 (GCLM)，谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)。还可以使用抗氧化剂基因(例如超氧 化物歧化酶1(S0D1))来实施这些方法。在一些实施方案中，所述方法还包括选择提高所述P2D或抗氧化剂基因或报告物构建体表达的级分，并进一步分开所述级分，以便生成两种或更多种亚级分；提供表达 F0X01基因或包含F0X01基因启动子的报告物构建体的细胞；使所述细胞与所述亚级分接 触；检测所述亚级分对所述F0X01基因或报告物构建体表达的影响；并选择提高所述F0X01 基因或报告物构建体的表达的亚级分。在一些实施方案中，所述方法还包括选择提高所述P2D或抗氧化剂基因或报告物 构建体表达的级分，并进一步分开所述级分，以便生成两种或更多种亚级分；使细胞与所述 亚级分接触；检测所述亚级分对所述细胞中的8-羟基-2’ -脱氧鸟苷(8-0HdG)水平的影 响；并选择降低所述细胞中的8-0HdG水平的亚级分。在又一方面，本专利技术提供了鉴定提高叉头框01 (F0X01)基因在细胞中表达的化合 物的方法。该方法包括提供表达(i)F0X01基因或(ii)包含F0X01基因启动子的报告物构 建体的细胞；提供植物提取物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合物，其包含白柳提取物或其活性级分，其中所述组合物提高阶段Ⅱ解毒酶（Ｐ２Ｄ）基因和抗氧化剂酶基因之一或两者在细胞中的表达。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-9-11 60/993,325一种组合物，其包含白柳提取物或其活性级分，其中所述组合物提高阶段II解毒酶(P2D)基因和抗氧化剂酶基因之一或两者在细胞中的表达。2.权利要求1的组合物，其中所述组合物提高如下基因的表达选自谷氨酸-半胱氨 酸连接酶修饰物亚基(GCLM)和谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)的P2D基因；或 包括超氧化物歧化酶I(SODl)的抗氧化剂酶基因。3.权利要求1的组合物，其中所述组合物还提高F0X01的表达和/或降低8-羟 基-2，-脱氧鸟苷(S-OHdG)的水平。4.权利要求1的组合物，其中将所述组合物配制用于口服。5.权利要求4的组合物，其进一步包含一种或多种口服可接受载体和添加剂。6.权利要求1的组合物，其中将所述组合物配制用于表面施用。7.权利要求6的组合物，其进一步包含一种或多种表面可接受载体和添加剂。8.一种提高柳提取物的阶段II解毒酶(P2D)或抗氧化剂酶增强活性的方法，该方法包括提供具有第一水平的P2D或抗氧化剂酶增强活性的柳提取物； 对所述提取物分级，以便获得两种或更多种级分； 选择具有0. 5或更大的Rf值的级分； 测定所述级分的P2D或抗氧化剂酶增强活性；并且若级分具有比P2D或抗氧化剂酶增强活性的第一水平高的P2D或抗氧化剂酶增强活性 水平，则选择该级分。9.权利要求8的方法，其中对所述提取物分级包括使用一种或多种选自下组的方法 柱层析、液液分级、和固液分级。10.一种鉴定提高阶段II解毒酶(P2D)或抗氧化剂酶基因在细胞中表达的化合物的方 法，该方法包括(a)提供表达(i)P2D或抗氧化剂酶基因或(ii)包含P2D或抗氧化剂酶基因启动子的 报告物构建体的细胞；(b)提供植物提取物的级分；(c)使所述细胞与所述级分接触；并(d)检测所述级分对所述P2D或抗氧化剂酶基因或报告物构建体表达的影响， 其中提高所述P2D或抗氧化剂酶基因或报告物构建体表达的级分包含提高阶段II解毒酶(P2D)或抗氧化剂酶基因在细胞中表达的化合物。11.权利要求10的方法，进一步包括(e)选择提高所述P2D或抗氧化剂酶基因或报告物构建体表达的级分，并进一步分开 所述级分，以便生成两种或更多种亚级分；(f)提供表达P2D或抗氧化剂酶基因或包含P2D基因启动子的报告物构建体的细胞；(g)使所述细胞与所述亚级分接触；并(h)检测所述亚级分对所述P2D或抗氧化剂酶基因或报告物构建体表达的影响， 其中提高所述P2D或抗氧化剂酶基因或报告物构建体表达的亚级分包含提高阶段II解毒酶(P2D)或抗氧化剂酶基因在细胞中表达的化合物。12.权利要求11的方法，进一步包括重复步骤(e)至(h)，直至获得纯化的化合物。13.权利要求12的方法，进一步包括将所述纯化的化合物配制用于口服。14.权利要求12的方法，进一步包括将所述纯化的化合物配制用于表面施用。15.权利要求10-14任一项的方法，其中所述细胞是培养细胞、外周血单个核细胞 (PBMC)、成纤维细胞、或秀丽隐杆线虫中的细胞。16.权利要求10的方法，其中所述植物提取物是柳提取物。17.权利要求15的方法，其中所述秀丽隐杆线虫中的细胞是ASI细胞。18.权利要求8-12任一项的方法，其中所述P2D基因选自下组谷氨酸-半胱氨酸连 接酶修饰物亚基(GCLM)，谷氨酸-...

【专利技术属性】
技术研发人员：T基思布莱克韦尔，松本元伸，牧野武利，后藤昌史，石角笃，前田真理子，畴地里衣，
申请(专利权)人：乔斯林糖尿病中心股份有限公司，太阳星光齿磨公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]