铁皮石斛组培工厂化育苗方法技术

本发明专利技术公开了一种铁皮石斛组培工厂化育苗方法，涉及生物技术领域，该铁皮石斛组培工厂化育苗方法通过简单易行的方法对田间杂乱种质进行筛选，筛选出高产、抗病、外观、口感良好且质量符合中国药典标准的铁皮石斛茎段，极大的缩短了品种筛选时间；培养过程中MS培养基中大量元素的改良、添加物中增加黄腐酸钙和新型食品抗氧化剂异抗坏血酸钠或抗坏血酸钙、培养条件使用色温4000K的led光源的照明、以及在生产壮苗过程中循环转接一定规格的小苗，提高了组培苗的生长速度，减少了生产过程中小苗褐化、黄化、生长不良的状况和组培苗的周转次数，从而提高了工厂化生产效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，更具体地说，本专利技术涉及一种铁皮石斛组培工厂化育苗方法。
技术介绍
铁皮石斛在临床上及中药复方中被广泛应用。铁皮石斛的应用主要以采集野生资源为主，随着野生资源的日渐枯竭，人工铁皮石斛种植大量兴起。而目前大多数铁皮石斛人工种植种苗都来自于分株、扦插和种子无菌播种繁殖，前两种方式徒耗大量资源并且发展缓慢，后种方式属于有性繁殖，有一定的生产效率，但是该方法存在种苗变异性大，性质表现不一致导致药材理化指标波动太大，不能满足中药材GAP对药材质量控制的平稳性。田间筛选高产、抗病、外观、口感良好的铁皮石斛单丛进行理化指标分析，理化指标符合中国药典要求后利用其单株茎段进行克隆，对于优质种苗商品化的生产和资源的合理利用具有重要的意义。现有石斛组培工厂化育苗基本参考其他兰科属生产的培养基、添加物以及培养条件，虽然生产有一定效率，但是种苗培养过程依然存在原球茎、丛芽及幼苗褐化、黄化等死亡等现象。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题是提供一种铁皮石斛组培工厂化育苗方法。通过一系列简单易行的方法对田间种质进行筛选，培养过程中操作方法、培养基、添加物、以及培养条件改良来改善目前铁皮石斛组织培养生产的缺点。为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种铁皮石斛组培工厂化育苗方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)种源筛选：石斛生长旺季6～9月份对外观少病虫害，生长健壮的单丛种苗进行逐一标记，采集前每月喷施三次EM菌、黄腐酸钙和芸苔素，采收季节11～3月对所标记封顶成熟的种苗进行中国药典相应理化指标作全检，对符合药典标准的种苗进行茎段采集；(2)外植体预处理：将石斛鲜条茎段放入加入适量洗洁精的35～45℃温水中浸泡30～60分钟，将浸泡好的石斛茎段的叶鞘剥掉不能伤及节上潜伏芽，叶鞘剥掉的茎段切成每一节一个段，用异抗坏血酸钠或抗坏血酸钙50～200mg/L浸泡30～60分钟，然后用清水清洗吸水纸吸干表面水分待用；(3)外植体灭菌：将茎段用75％酒精浸10～15秒，立即放入0.1％升汞中8～12分钟，并不时轻晃，最后取出茎段用无菌水清洗4～5次，再用无菌吸水纸吸干表面水分待用；(4)茎段腋芽诱导：将切好茎段接入改良1号培养基内暗培养10～15天，腋芽开始萌动，之后使用色温4000KLED照明灯光照8～10小时/天，光照强度1000～1200lex，温度23～26℃；(5)丛芽诱导：待腋芽长到0.5～1cm时，切下芽体放入含有异抗坏血酸钠或抗坏血酸钙50～200mg/L无菌水中浸泡20～30分钟，每5分钟摇晃一次，每次一分钟，然后用无菌吸水纸吸干表面水分转入改良2号培养基中培养40～50天即可出现小丛芽。培养条件：使用色温4000KLED照明灯光照10～12小时/天，光照强度1800～2000lex，温度23～26℃；(6)丛芽增殖：将丛芽转入改良3号培养基中培养40～50天，丛芽几乎增殖长满整个接种瓶。培养条件：使用色温4000KLED照明灯光照10～12小时/天，光照强度1800～2000lex，温度23～26℃；(7)壮苗：将高0.3cm以上的丛芽接入改良4号培养基中培养50～60天，瓶内1.5cm以上小苗和1.5cm以下的小苗比例在7∶3～5∶5之间，将1.5cm以下小苗循环转入改良4号培养基中即可实现周年保持一定数量的生产。培养条件：使用色温4000KLED照明灯光照10～12小时/天，光照强度1800～2000lex，温度23～26℃；(8)生根出苗：将高1.5cm以上小苗接入改良5号培养基中培养80～90天，苗平均高度4～5cm，根系发达、叶色浓厚即可开瓶驯化。培养条件：使用色温4000KLED照明灯光照12～14小时/天，光照强度2000～2500lex，温度23～26℃。改良培养基配方如下：改良1号培养基：硝酸钙200mg/L、硝酸铵500mg/L、硝酸钾760mg/L、硫酸镁180mg/L、磷酸二氢钾100mg/L、螯合铁35mg/L、硫酸锰22.3mg/L、硫酸锌8.6mg/L、氯化钴0.025mg/L、硫酸铜0.025mg/L、钼酸钠0.025mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、烟酸0.5mg/L、VB60.5mg/L、VB10.1mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、土豆全粉10-15g/L、黄腐酸钙0.5g/L、萘乙酸0.05-0.2mg/L、6-苄基腺嘌呤0.2-0.6mg/L、异抗坏血酸钠或抗坏血酸钙20-100mg/L、白糖20g/L、琼脂4-5g/L、PH：5.6-6.0、水为去氯自来水；改良2号培养基：硝酸钙200mg/L、硝酸铵500mg/L、硝酸钾760mg/L、硫酸镁180mg/L、磷酸二氢钾100mg/L、螯合铁35mg/L、硫酸锰22.3mg/L、硫酸锌8.6mg/L、氯化钴0.025mg/L、硫酸铜0.025mg/L、钼酸钠0.025mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、烟酸0.5mg/L、VB60.5mg/L、VB10.1mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、土豆全粉10-15g/L、黄腐酸钙0.5g/L、萘乙酸0.2-0.3mg/L、6-苄基腺嘌呤2-3mg/L、异抗坏血酸钠或抗坏血酸钙20-100mg/L、白糖20g/L、琼脂4-5g/L、PH：5.6-6.0、水为去氯自来水；改良3号培养基：硝酸钙200mg/L、硝酸铵500mg/L、硝酸钾760mg/L、硫酸镁180mg/L、磷酸二氢钾100mg/L、螯合铁35mg/L、硫酸锰22.3mg/L、硫酸锌8.6mg/L、氯化钴0.025mg/L、硫酸铜0.025mg/L、钼酸钠0.025mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、烟酸0.5mg/L、VB60.5mg/L、VB10.1mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、土豆全粉10-15g/L、黄腐酸钙0.5g/L、萘乙酸0.2-0.5mg/L、6-苄基腺嘌呤0.5-1.5mg/L、异抗坏血酸钠或抗坏血酸钙20-100mg/L、白糖20g/L、琼脂4-5g/L、PH：5.6-6.0、水为去氯自来水；改良4号培养基：硝酸钙200mg/L、硝酸铵500mg/L、硝酸钾760mg/L、硫酸镁180mg/L、磷酸二氢钾100mg/L、螯合铁35mg/L、硫酸锰22.3mg/L、硫酸锌8.6mg/L、氯化钴0.025mg/L、硫酸铜0.025mg/L、钼酸钠0.025mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、烟酸0.5mg/L、VB60.5mg/L、VB10.1mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、土豆全粉10-15g/L、黄腐酸钙0.5-0.1g/L、萘乙酸0.2-0.5mg/L、6-苄基腺嘌呤0.05-0.2mg/L、异抗坏血酸钠或抗坏血酸钙20-100mg/L、白糖20g/L、琼脂4-5g/L、PH：5.6-6.0、水为去氯自来水；改良5号培养基：硝本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种铁皮石斛组培工厂化育苗方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)种源筛选：石斛生长旺季6～9月份对外观少病虫害，生长健壮的单丛种苗进行逐一标记，采集前每月喷施三次EM菌、黄腐酸钙和芸苔素，采收季节11～3月对所标记封顶成熟的种苗进行中国药典相应理化指标作全检，对符合药典标准的种苗进行茎段采集；(2)外植体预处理：将石斛鲜条茎段放入加入适量洗洁精的35～45℃温水中浸泡30～60分钟，将浸泡好的石斛茎段的叶鞘剥掉不能伤及节上潜伏芽，叶鞘剥掉的茎段切成每一节一个段，用异抗坏血酸钠或抗坏血酸钙50～200mg/L浸泡30～60分钟，然后用清水清洗吸水纸吸干表面水分待用；(3)外植体灭菌：将茎段用75％酒精浸10～15秒，立即放入0.1％升汞中8～12分钟，并不时轻晃，最后取出茎段用无菌水清洗4～5次，再用无菌吸水纸吸干表面水分待用；(4)茎段腋芽诱导：将切好茎段接入改良1号培养基内暗培养10～15天，腋芽开始萌动，之后使用色温4000K LED照明灯光照8～10小时/天，光照强度1000～1200lex，温度23～26℃；(5)丛芽诱导：待腋芽长到0.5～1cm时，切下芽体放入含有异抗坏血酸钠或抗坏血酸钙50～200mg/L无菌水中浸泡20～30分钟，每5分钟摇晃一次，每次一分钟，然后用无菌吸水纸吸干表面水分转入改良2号培养基中培养40～50天即可出现小丛芽。培养条件：使用色温4000K LED照明灯光照10～12小时/天，光照强度1800～2000lex，温度23～26℃；(6)丛芽增殖：将丛芽转入改良3号培养基中培养40～50天，丛芽几乎增殖长满整个接种瓶。培养条件：使用色温4000K LED照明灯光照10～12小时/天，光照强度1800～2000lex，温度23～26℃；(7)壮苗：将高0.3cm以上的丛芽接入改良4号培养基中培养50～60天，瓶内1.5cm以上小苗和1.5cm以下的小苗比例在7∶3～5∶5之间，将1.5cm以下小苗循环转入改良4号培养基中即可实现周年保持一定数量的生产。培养条件：使用色温4000K LED照明灯光照10～12小时/天，光照强度1800～2000lex，温度23～26℃；(8)生根出苗：将高1.5cm以上小苗接入改良5号培养基中培养80～90天，苗平均高度4～5cm，根系发达、叶色浓厚即可开瓶驯化。培养条件：使用色温4000K LED照明灯光照12～14小时/天，光照强度2000～2500lex，温度23～26℃。...

【技术特征摘要】
1.一种铁皮石斛组培工厂化育苗方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)种源筛选：石斛生长旺季6～9月份对外观少病虫害，生长健壮的单丛种苗进行逐一标记，采集前每月喷施三次EM菌、黄腐酸钙和芸苔素，采收季节11～3月对所标记封顶成熟的种苗进行中国药典相应理化指标作全检，对符合药典标准的种苗进行茎段采集；(2)外植体预处理：将石斛鲜条茎段放入加入适量洗洁精的35～45℃温水中浸泡30～60分钟，将浸泡好的石斛茎段的叶鞘剥掉不能伤及节上潜伏芽，叶鞘剥掉的茎段切成每一节一个段，用异抗坏血酸钠或抗坏血酸钙50～200mg/L浸泡30～60分钟，然后用清水清洗吸水纸吸干表面水分待用；(3)外植体灭菌：将茎段用75％酒精浸10～15秒，立即放入0.1％升汞中8～12分钟，并不时轻晃，最后取出茎段用无菌水清洗4～5次，再用无菌吸水纸吸干表面水分待用；(4)茎段腋芽诱导：将切好茎段接入改良1号培养基内暗培养10～15天，腋芽开始萌动，之后使用色温4000KLED照明灯光照8～10小时/天，光照强度1000～1200lex，温度23～26℃；(5)丛芽诱导：待腋芽长到0.5～1cm时，切下芽体放入含有异抗坏血酸钠或抗坏血酸钙50～200mg/L无菌水中浸泡20～30分钟，每5分钟摇晃一次，每次一分钟，然后用无菌吸水纸吸干表面水分转入改良2号培养基中培养40～50天即可出现小丛芽。培养条件：使用色温4000KLED照明灯光照10～12小时/天，光照强度1800～2000lex，温度23～26℃；(6)丛芽增殖：将丛芽转入改良3号培养基中培养40～50天，丛芽几乎增殖长满整个接种瓶。培养条件：使用色温4000KLED照明灯光照10～12小时/天，光照强度1800～2000lex，温度23～26℃；(7)壮苗：将高0.3cm以上的丛芽接入改良4号培养基中培养50～60天，瓶内1.5cm以上小苗和1.5cm以下的小苗比例在7∶3～5∶5之间，将1.5cm以下小苗循环转入改良4号培养基中即可实现周年保持一定数量的生产。培养条件：使用色温4000KLED照明灯光照10～12小时/天，光照强度1800～2000lex，温度23～26℃；(8)生根出苗：将高1.5cm以上小苗接入改良5号培养基中培养80～90天，苗平均高度4～5cm，根系发达、叶色浓厚即可开瓶驯化。培养条件：使用色温4000KLED照明灯光照12～14小时/天，光照强度2000～2500lex，温度23～26℃。2.按照权利要求1所述的一种铁皮石斛组培工厂化育苗方法，其特征在于：所述改良培养基配方如下：改良1号培养基：硝酸钙200mg/L、硝酸铵500mg/L、硝酸钾760mg/L、硫酸镁180mg/L、磷酸二氢钾100mg/L、螯合铁35mg/L、硫酸锰22.3mg/L、硫酸锌8.6mg/L、氯化钴0.025mg/L、硫酸铜0.025mg/L、钼酸钠0.025mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、烟酸0.5mg/L、VB60.5mg/L、VB10.1mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、土豆全粉10-15g/L、黄腐酸钙0.5g/L、萘乙酸0.05-0.2mg/L、6-苄基腺嘌呤0.2-0.6mg/L、异抗坏血酸钠或抗坏血酸钙20-100mg/L、白糖20g/L、琼脂4-5g/L、PH：5.6-6.0、水为去...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘中侨，
申请(专利权)人：耿马四方生物科技开发有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南;53