一种专用铁皮石斛叶鞘组培成苗方法技术

本发明专利技术公开一种专用铁皮石斛叶鞘组培成苗方法，包括以下四个步骤：第1步，外植体选择；第2步，外植体处理；第3步，成苗培养基；第4步，炼苗和栽培。本方法采用铁皮石斛的叶鞘进行组织培养得到的愈伤组织，提高了出愈率，降低了玻璃化，不定芽分化率达到62.67%，每个愈伤组织块可形成多个不定芽，有效保证生根率，大大提高繁殖速度及繁殖量，培养的铁皮石斛比市场上的营养成份比较高，提高产量与品质。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种专用铁皮石斛叶鞘组培成苗方法。
技术介绍
铁皮石斛，是一种濒危植物，也是一种很好的中药，其有益胃生津、滋阴清热、滋补养生的功效，铁皮石斛的发展能够很好的弘扬中药文化，但是铁皮石斛对生长环境的要求苛刻，喜在温暖、潮湿、半阴半阳的环境中生长，但不能栽培在普通土壤中，多依附于大树干上和石壁石缝中，而且生长周期长，大约需要五六年的时间。石斛开花多，结果少，种子细如粉尘，每粒重约0.3-0.4μg，不易收集进行规模化的发展，而种胚的发育不能超过球形阶段，缺乏胚乳组织，需要与真菌共生才能萌芽，有性繁育困难。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服以上的不足，提供步骤合理科学，功能实用，育苗效果好的一种专用铁皮石斛叶鞘组培成苗方法。本专利技术的目的通过以下技术方案来实现：一种专用铁皮石斛叶鞘组培成苗方法，包括以下步骤：第1步，外植体选择，选取当年生幼嫩的铁皮石斛顶端带叶鞘的叶基部为外植体，将外植体用流水洗涤，去除灰尘，再用洗洁精浸泡15min后，再流水冲洗干净；第2步，外植体处理，将干净的外植体置于超净工作台上，放置于烧杯中，用75%酒精消毒30s，无菌水反复冲洗5－6次；再用0.1%升汞消毒3min，无菌水反复冲洗5－6次；外植体置于无菌滤纸上吸干水分，切去与叶鞘的边缘部分，保留叶鞘带肉质部位，切成0.5cm×0.5cm的大小接种上，为避免交叉感染，每瓶接种2个；第3步，成苗培养基，叶片灭菌处理后接种于诱导培养基，温度25±2℃，暗培养10d，在放入光照时间12h·d-1，光照强度1200±100Lx环境下经45天诱导形成愈伤组织，再将愈伤组织转至分化培养基，在同样条件下，培养55天获得不定芽；再将不定芽切成每一个小苗，接种在生根培养基中，在同样条件下，培养38天即可获得根系长至2-3cm成苗；所述诱导培养基为：改良MS基本培养基，添加2，4－D0.8-1.3mg·L-1+6-BA0.6-2.0mg·L-1+椰汁5-9%+土豆汁3%-7%，附加蔗糖30g·L-1，琼脂6.2g·L-1，pH为5.8；所述分化培养基为：改良MS基本培养基，添加6-BA0.5-3.0mg·L-1+NAA0.2-0.4mg·L-1+氨基酸13-20%，附加蔗糖30g·L-1，琼脂6.2g·L-1，水解酪蛋白300mg·L-1，pH为5.8；所述生根培养基为：改良1/2MS基本培养基，添加，GA30.1-0.3mg·L-1+NAA0.4-0.8mg·L-1，附加蔗糖30g·L-1，琼脂6.2g·L-1，活性炭1.5g·L-1，pH为5.8；其中所述改良MS基本培养基配方是将MS培养基中的大量元素含量改良为KNO3175mg·L-1、NH4NO3280mg·L-1、MgSO4·7H2O115mg·L-1、CaCl2·2H2O300mg·L-1、KH2PO4275mg·L-1，铁盐中Na2.EDTA50.7mg·L-1，有机成分中甘氨酸8mg·L-1，其它微量元素、铁盐与有机成分含量不变；第4步，炼苗和栽培，选择根系发达生长健壮的无菌苗，室内开瓶炼苗3天，取出后洗净根部琼脂，在温室专用基质中盆栽，温室温度控制在20-25℃，湿度控制在60-70%，光度的控制在1400-1700Lx；专用基质采用松树皮、稻糠和泥炭土，经高温消毒后，采用6：2：2的比例配置。本专利技术的进一步改进在于：所述第4步中松树皮直径为1-1.2cm。本专利技术与现有技术相比具有以下优点：本方法采用铁皮石斛的叶鞘进行组织培养得到的愈伤组织，出愈率比其他方法提高26%，玻璃化降低10%；愈伤组织上分化出来的芽，不定芽分化率为62.67%，每个愈伤组织块可形成3-11个不定芽；生根率达100%。此方法可大大提高繁殖速度及繁殖量，培养的铁皮石斛比市场上的营养成份比较高，不仅提高产量，更提高了品质。具体实施方式：为了加深对本专利技术的理解，下面将结合实施例对本专利技术作进一步详述，该实施例仅用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术保护范围的限定。实施例一种专用铁皮石斛叶鞘组培成苗方法，包括以下步骤：第1步，外植体选择，选取当年生幼嫩的铁皮石斛顶端带叶鞘的叶基部为外植体，将外植体用流水洗涤，去除灰尘，再用洗洁精浸泡15min后，再流水冲洗干净；第2步，外植体处理，将干净的外植体置于超净工作台上，放置于烧杯中，用75%酒精消毒30s，无菌水反复冲洗6次；再用0.1%升汞消毒3min，无菌水反复冲洗5次；外植体置于无菌滤纸上吸干水分，切去与叶鞘的边缘部分，保留叶鞘带肉质部位，切成0.5cm×0.5cm的大小接种上，为避免交叉感染，每瓶接种2个；第3步，成苗培养基，叶片灭菌处理后接种于诱导培养基，温度26℃，暗培养10d，在放入光照时间12h·d-1，光照强度1250Lx环境下经45天诱导形成愈伤组织，再将愈伤组织转至分化培养基，在同样条件下，培养55天获得不定芽；再将不定芽切成每一个小苗，接种在生根培养基中，在同样条件下，培养38天即可获得根系长至2.5cm成苗；所述诱导培养基为：改良MS基本培养基，添加2，4－D0.8-1.3mg·L-1+6-BA0.6-2.0mg·L-1+椰汁5-9%+土豆汁3%-7%，附加蔗糖30g·L-1，琼脂6.2g·L-1，pH为5.8；所述分化培养基为：改良MS基本培养基，添加6-BA0.5-3.0mg·L-1+NAA0.2-0.4mg·L-1+氨基酸13-20%，附加蔗糖30g·L-1，琼脂6.2g·L-1，水解酪蛋白300mg·L-1，pH为5.8；所述生根培养基为：改良1/2MS基本培养基，添加，GA30.1-0.3mg·L-1+NAA0.4-0.8mg·L-1，附加蔗糖30g·L-1，琼脂6.2g·L-1，活性炭1.5g·L-1，pH为5.8；其中所述改良MS基本培养基配方是将MS培养基中的大量元素含量改良为KNO3175mg·L-1、NH4NO3280mg·L-1、MgSO4·7H2O115mg·L-1、CaCl2·2H2O300mg·L-1、KH2PO4275mg·L-1，铁盐中Na2.EDTA50.7mg·L-1，有机成分中甘氨酸8mg·L-1，其它微量元素、铁盐与有机成分含量不变；第4步，炼苗和栽培，选择根系发达生长健壮的无菌苗，室内开瓶炼苗3天，取出后洗净根部琼脂，在温室专用基质中盆栽，温室温度控制在23℃，湿度控制在65%，光度的控制在1550Lx；专用基质采用松树皮（直径为1-1.2cm）、稻糠和泥炭土，经高温消毒后，采用6：2：2的比例配置。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种专用铁皮石斛叶鞘组培成苗方法，其特征在于：包括以下步骤：第1步，外植体选择，选取当年生幼嫩的铁皮石斛顶端带叶鞘的叶基部为外植体，将外植体用流水洗涤，去除灰尘，再用洗洁精浸泡15min后，再流水冲洗干净；第2步，外植体处理，将干净的外植体置于超净工作台上，放置于烧杯中，用75%酒精消毒30s，无菌水反复冲洗5－6次；再用0.1%升汞消毒3min，无菌水反复冲洗5－6次；外植体置于无菌滤纸上吸干水分，切去与叶鞘的边缘部分，保留叶鞘带肉质部位，切成0.5cm×0.5cm的大小接种上，每瓶接种2个；第3步，成苗培养基，叶片灭菌处理后接种于诱导培养基，温度25±2℃，暗培养10d，在放入光照时间12h·d‑1，光照强度1200±100Lx 环境下经45天诱导形成愈伤组织，再将愈伤组织转至分化培养基，在同样条件下，培养55天获得不定芽；再将不定芽切成每一个小苗，接种在生根培养基中，在同样条件下，培养38天即可获得根系长至2‑3cm成苗；所述诱导培养基为：改良MS基本培养基，添加2，4－D 0.8‑1.3 mg·L‑1+ 6‑BA 0.6‑2.0mg·L‑1+椰汁5‑9%+土豆汁3%‑7%，附加蔗糖30g·L‑1，琼脂6.2g·L‑1，pH为5.8；所述分化培养基为：改良MS基本培养基，添加 6‑BA 0.5‑3.0mg·L‑1+ NAA 0.2‑0.4mg·L‑1+氨基酸13‑20%，附加蔗糖30g·L‑1，琼脂6.2g·L‑1，水解酪蛋白300mg·L‑1，pH为5.8；所述生根培养基为：改良1/2MS基本培养基，添加，GA3 0.1‑0.3 mg·L‑1 + NAA 0.4‑0.8 mg·L‑1，附加蔗糖30g·L‑1，琼脂6.2g·L‑1，活性炭1.5 g·L‑1，pH为5.8；其中改良MS基本培养基配方是将MS培养基中的大量元素含量改良为KNO3 175 mg·L‑1、NH4NO3 280 mg·L‑1、MgSO4·7H2O 115 mg·L‑1、CaCl2·2H2O 300 mg·L‑1、KH2PO4 275 mg·L‑1，铁盐中Na2.EDTA 50.7 mg·L‑1，有机成分中甘氨酸8 mg·L‑1，其它微量元素、铁盐与有机成分含量不变；第4步，炼苗和栽培，选择根系发达生长健壮的无菌苗，室内开瓶炼苗3天，取出后洗净根部琼脂，在温室专用基质中盆栽，温室温度控制在20‑25℃，湿度控制在60‑70%，光度的控制在1400‑1700Lx；专用基质采用松树皮、稻糠和泥炭土，经高温消毒后，采用6：2：2的比例配置。...

【技术特征摘要】
1.一种专用铁皮石斛叶鞘组培成苗方法，其特征在于：包括以下步骤：
第1步，外植体选择，选取当年生幼嫩的铁皮石斛顶端带叶鞘的叶基部为外植体，将外
植体用流水洗涤，去除灰尘，再用洗洁精浸泡15min后，再流水冲洗干净；
第2步，外植体处理，将干净的外植体置于超净工作台上，放置于烧杯中，用75%酒精消
毒30s，无菌水反复冲洗5－6次；再用0.1%升汞消毒3min，无菌水反复冲洗5－6次；外植体置
于无菌滤纸上吸干水分，切去与叶鞘的边缘部分，保留叶鞘带肉质部位，切成0.5cm×0.5cm
的大小接种上，每瓶接种2个；
第3步，成苗培养基，叶片灭菌处理后接种于诱导培养基，温度25±2℃，暗培养10d，在
放入光照时间12h·d-1，光照强度1200±100Lx环境下经45天诱导形成愈伤组织，再将愈伤
组织转至分化培养基，在同样条件下，培养55天获得不定芽；再将不定芽切成每一个小苗，
接种在生根培养基中，在同样条件下，培养38天即可获得根系长至2-3cm成苗；所述诱导培
养基为：改良MS基本培养基，添加2，4－D0.8-1.3mg·L-1+6-BA0.6-2.0mg·L-1+椰汁5-
9%+土豆汁3%-7%，附加蔗糖30g·L-1，琼脂6.2g·L-1，pH为5.8；所述分化培养基为：改良MS
基本培养基，添加6-BA0...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴云新，马赞留，蔡红海，钱海云，崔成华，邬荣领，王建新，
申请(专利权)人：江苏远鹏基因组研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32