ＨＣＶ基因型分型和表型分型制造技术

本发明专利技术包括ＨＣＶ基因型分型和表型分型的方法。在一个实施方式中，本发明专利技术的方法可用于确定ＨＣＶ分离体是否对于抗病毒药物有抗性。本发明专利技术还包括用于扩增ＨＣＶ?ＮＳ３区域的引物和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及HCV基因型分型(genotyping)和表型分型(phenotyping)分析。例 如，本专利技术包括用于扩增HCV的NS3蛋白酶结构域的组合物和引物。
技术介绍
丙型肝炎(HCV)是黄病毒科的带包膜的正链RNA病毒。单链的HCVRNA基因组是 正极性的且包含一个长度为大约9600个核苷酸的开放读码框，其编码大约3010个氨基酸 的多聚蛋白。在受感染的细胞中，多聚蛋白在多个位点被宿主和病毒蛋白酶切割，从而产生 病毒的结构和非结构(NS)蛋白。结构蛋白(C、El、E2/NS1)组成核衣壳蛋白和一个或两个与膜结合的糖蛋白。非 结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)是催化并调节HCV RNA基因组复制的酶或 辅助因子。NS3既是蛋白水解切割酶又是解旋酶(为了复制而促进病毒基因组的解螺旋)。 NS5b是病毒复制所需的RNA依赖性的RNA聚合酶。HCV影响世界上大约3%的人口(170，000，000人)并且已经被世界卫生组织宣布 为全球性健康传染病。约50%至80%的感染了 HCV的人发展为具有病毒抗性的慢性肝炎。 具有慢性肝炎的个体发展为肝硬化和肝细胞癌的风险日益增加。HCV引起的末期肝病大约 占到肝移植的30%至40%。目前全球的HCV治疗标准是聚乙二醇化的a-干扰素与利巴韦林(一种广谱抗病 毒试剂)联用。但是，该方案持续很久且不良好耐受。而且，只有大约一半的感染基因型 1HCV的个体对治疗具有持久反应。业界对于有效且安全替代干扰素或者可以用于含有干扰素的方案的治疗剂有很 大的需要。几种HCV抗病毒治疗处于临床试验中。例如，这些治疗剂包括病毒蛋白酶抑制 剂和聚合酶抑制剂。已经开发了 HCV蛋白酶NS3的抑制剂，其同时为高活性和选择性的。 为此原因，这些化合物具有成为下一代抗HCV治疗的前景(参见，例如，W0 00/09543、TO 00/09558和W000/59929，每篇皆通过引用全文并入本文)。尽管在用于感染HCV的患者的新的治疗选择的开发上取得了进步，但是药物抗性 仍是主要问题。由于缺少RNA依赖性的RNA聚合酶的修复活性，HCV表现出高度遗传多样 性。由于HCV聚合酶的保真率差，所以在接受特异性HCV抗病毒治疗剂(例如，蛋白酶抑制 剂和聚合酶抑制剂)治疗的患者中可能产生药物抗性HCV突变，这与已经在接受HIV抗病 毒治疗剂治疗的患者中观察到的情况相似。除了对特异性靶向HCV的抗病毒治疗产生抗性 之外，病毒能够对非特异性抗病毒治疗剂(例如干扰素)产生抗性。对蛋白酶抑制剂的药物抗性受到特别关注。体外研究已经表明HCV蛋白酶中的突 变能够产生对蛋白酶抑制剂的抗性。这个发现与HIV蛋白酶中的发现是类似的。例如，在5HIV中，已经发现HIV蛋白酶中的特异性突变导致对HIV蛋白酶抑制剂的表型敏感性降低。本专利技术提供了可用于确定HCV基因型和HCV表型的引物、试剂盒和方法。例如，本 专利技术的方法可用于预测患者对HCV治疗剂的反应和用于确定HCV药物抗性(例如蛋白酶药 物抗性)。本专利技术的方法还可用于临床前的药物开发以按活性筛选有前景的蛋白酶抑制剂。专利技术概述本专利技术部分基于对鉴定丙型肝炎病毒(HCV)亚型有用的引物的发现和用于HCV基 因型分型和表型分型的方法的发现。因此，本专利技术提供了引物、包含引物的试剂盒、用于扩 增HCV(例如基因型1的HCV)的特定区域的方法、用于确定HCV的基因型和表型(例如基 因型la或lb等)的方法。本专利技术还包括用于确定存在药物抗性HCV的方法。本专利技术提供了引物的群体。引物的群体可以包含第一或第二轮引物。在一 个实施方式中，每个引物包含编码 Met/Lys-Glu/Gly-Thr/I le-Lys-I le/Val/Leu-I le/ Ala-Thr/Gln-Trp/Lys的核酸序列。在另一个实施方式中，每个引物的互补物包含编码 Ser-Thr-Tyr-Gly/Cys-Lys-Phe-Leu-Ala-Asp-Gly 的核酸序列。在另一个实施方式中，每个引物包含编码Ala-Pro/Hi s_11 e-Thr-Ala-Tyr-Ser/ Ala-Gln/Arg-Gln-Thr的核酸序列。在另一个实施方式中，每个引物的互补物包含编码 Gly-Ser-Gly/Arg-Lys-Ser/Thr-Thr/Asn-Lys/Arg-Val-Pro-Ala/Val-Ala/Asp 的核酸序 列。在另一个实施方式中，提供了包含本专利技术引物的试剂盒。本专利技术提供了扩增编码HCV NS3蛋白酶结构域的核酸的方法。本专利技术的方法包括， 例如，扩增编码NS3/4A结构域或其部分、NS3结构域或其部分(例如，NS3蛋白酶和NS3解 旋酶两者，或NS3蛋白酶和一部分的NS3解旋酶)、NS2/NS3结构域或其部分或NS2/NS3/4A 结构域或其部分的核酸。本专利技术包括使用第一和/或第二轮引物扩增HCV蛋白酶结构域。在本专利技术的 一个实施方式中，第二轮引物(即第二组)嵌套于使用第一组引物所扩增的核酸区域 内。例如，本专利技术包括使用第一轮引物扩增编码蛋白酶结构域的HCV核酸，所述第一轮 引物包含编码 Met/Lys-Glu/Gly-Thr/Ile-Lys-Ile/Val/Leu-Ile/Ala-Thr/Gln-Trp/ Lys 和 Ser-Thr-Tyr-Gly/Cys-Lys-Phe-Leu-Ala-Asp-Gly 的核酸序列。第二轮引物可以 包含编码 Ala-Pro/His-Ile-Thr-Ala-Tyr-Ser/Ala-Gln/Arg-Gln-Thr 和 Gly-Ser-Gly/ Arg-Lys-Ser/Thr-Thr/Asn-Lys/Arg-Val-Pro-Ala/Val-Ala/Asp 的核酸序列。本专利技术包括使用本专利技术的引物扩增核酸样品的方法，所述核酸样品来自于被HCV 感染或怀疑被HCV感染的患者的样品。在本专利技术的一个方面，使用基因型非特异性简并引 物扩增HCV蛋白酶结构域。在本专利技术的另一个方面，使用基因型特异性非简并引物扩增HCV 蛋白酶结构域。在本专利技术的另一个方面，使用锁(locked)核酸(LNA)引物扩增HCV蛋白酶 结构域。使用本专利技术的引物仅仅基于编码NS3蛋白酶结构域的核酸序列中的变异而对HCV 进行基因型分型是可能的。本专利技术包括使用本专利技术的引物通过本领域已知的基于核酸的方 法(例如，PCR扩增、测序和杂交方法)对HCV进行基因型分型。在本专利技术的一个实施方式中，通过扩增NS3蛋白酶结构域和/或对NS3蛋白酶结 构域进行测序而确定HCV基因型。例如，本专利技术包括扩增HCV的蛋白酶结构域内的核酸片段6并基于片段序列确定HCV的基因型的方法。在本专利技术的一个方面，通过使用基因型非特异 性简并引物扩增HCV蛋白酶结构域并对所扩增的核酸产物进行测序而确定HCV的基因型。 在本专利技术的另一个方面，通过使用基因型特异性非简并引物扩增HCV蛋白酶结构域并对所 扩增的核酸产物进行测序而确定HCV的基因型。例如，使用本专利技术的方法，可以通过将靶序 列与已知基因型(例如Ia和/或lb HCV)的序列相比较而确定HCV的基因型。本专利技术还提供了确定例如在携带基因型1的HCV的患者中存在药物抗性HCV本文档来自技高网...

【技术保护点】
第一轮上游引物的群体，其中每个引物包含编码Ｍｅｔ／Ｌｙｓ－Ｇｌｕ／Ｇｌｙ－Ｔｈｒ／Ｉｌｅ－Ｌｙｓ－Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ－Ｉｌｅ／Ａｌａ－Ｔｈｒ／Ｇｌｎ－Ｔｒｐ／Ｌｙｓ的核酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-10-30 60/983854;US 2008-4-7 61/043020第一轮上游引物的群体，其中每个引物包含编码Met/Lys-Glu/Gly-Thr/Ile-Lys-Ile/Val/Leu-Ile/Ala-Thr/Gln-Trp/Lys的核酸序列。2.根据权利要求1所述的引物的群体，其中每个引物编码氨基酸序列并且其中所述的 氨基酸序列的群体具有以下的每种氨基酸的分布Met (99. 5 % )/Lys (0.5 % )-Glu (99. 5 % )/Gly(0. 5 % )-Thr (96. 5 % )/ Ile(3. 5 % )-Lys (100 % )-lie (69. 3 % )/Val(16. 1 % )/Leu(14. 6 % )-lie (99. 5 % )/ Ala(0. 5% ) -Thr (99. 5% ) /Gln (0. 5% ) -Trp (99. 5% ) /Lys (0. 5% ) 3.根据权利要求1所述的引物的群体，其中每个引物包含核酸序列 ATGGAGACYAAGVTYATYACSTGGG，其中 Y 是 C 或 T，V 是 A 或 G 或 C，S 是 G 或 C。4.根据权利要求1所述的引物的群体，其中每个引物包含核酸序列 ATGGAGACYAMAMGVTYAMTYAMCSTGGG，其中 Y 是 C 或 T，V 是 A 或 G 或 C，S 是 G 或 C，并且其中 AM是修饰的腺苷。5.根据权利要求1所述的引物的群体，其中每个引物包含核酸序列AMTGMGMAGACYAMAM GVTYAMTYAMCMSTGGG,其中Y是C或T，V是A或G或C，S是G或C，并且其中AM是修饰的腺 苷，GM是修饰的鸟苷。6.根据权利要求1所述的引物的群体，其中该群体包含至少1个引物。7.第一轮下游引物的群体，其中每个引物的互补物包含编码Ser-Thr-Tyr-Gly/ Cys-Lys-Phe-Leu-Ala-Asp-Gly 的核酸序列。8.根据权利要求7所述的引物的群体，其中每个引物的互补物编码氨基酸序列并且其 中所述的氨基酸序列的群体具有以下的每种氨基酸的分布Ser (100 % ) -Thr (100 % ) -Tyr ( 100% )-Gly (97. 0% )/Cys (3. 0%) -Lys (100%)-Phe (100%)-Leu(100%) -Ala(100% )-Asp ( 100% )-Gly(100% )。9.根据权利要求7所述的引物的群体，其中每个引物包含核酸序列 CCGTCGGCAAGRAACTTGCCRTAGGTGGA，其中 R 是 A 或 G。10.根据权利要求7所述的引物的群体，其中每个引物包含核酸序列CCGTCGGCAAGRAMA CTTMGCCRTMAGGTMGGA，其中R是A或G，并且其中AM是修饰的腺苷，TM是修饰的胸苷。11.根据权利要求7所述的引物的群体，其中每个引物包含核酸序列CCGTMCGGCAAMGRA MACTMTMGCCRTMAMGGTMGGA，其中R是A或G，并且其中AM是修饰的腺苷，TM是修饰的胸苷。12.根据权利要求7所述的引物的群体，其中群体包含至少1个引物。13.第二轮上游引物的群体，其中每个引物包含编码Ala-Pro/ His-Ile-Thr-Ala-Tyr-Ser/Ala-Gln/Arg-Gln-Thr 的核酸序列。14.根据权利要求13所述的引物的群体，其中每个引物编码氨基酸序列并且其中所述 的氨基酸序列的群体具有以下的每种氨基酸的分布Ala (100 % ) -Pro (99. 5%)/His(0. 5% )-lie (100% ) -Thr (100%) -Ala (100 % ) -Tyr (1 00% )-Ser (66% )/Ala(34% )-Gln(99% )/Arg(l% )-Gln(100% )-Thr (100% )。15.根据权利要求13所述的引物的群体，其中每个引物包含核酸序列 GCGCCYATYACGGCCTAYKCCCARCARAC，其中 Y 是 C 或 T，K 是 G 或 T，R 是 A 或 G。16.根据权利要求13所述的引物的群体，其中每个引物包含核酸序列GCGCCYAMTMYACG GCMCTMAMYKCCCMARCMAMRAC，其中Y是C或T，K是G或T，R是A或G，并且其中AM是修饰的腺苷，CM是修饰的胞苷，TM是修饰的胸苷。17.根据权利要求13所述的引物的群体，其中每个引物包含核酸序列GCGCCYAMTMYAC GGCCTAMYKCCCARCAMRAC，其中Y是C或T，K是G或T，R是A或G，并且其中AM是修饰的腺 苷，TM是修饰的胸苷。18.根据权利要求13所述的引物的群体，其中每个引物包含核酸序列AGGGCATTTAAATA GCCACCATGGCGCCYATYACGGCCTAYKCCCARCARAC，其中 Y 是或 1\1(是6或11，1 是4或6。19.根据权利要求13所述的引物的群体，其中每个引物包含核酸序列AAAAAGGCGCGCCA CCATGGCGCCYATYACGGCCTAYKCCCARCARAC，其中 Y 是 C 或 T，K 是 G 或 T，R 是 A 或 G。20.根据权利要求13所述的引物的群体，其中该群体包含至少1个引物。21.第二轮下游引物的群体，其中每个引物的互补物包含编码Gly-Ser-Gly/ Arg-Lys-Ser/Thr-Thr/Asn-Lys/Arg-Val-Pro-Ala/Val-Ala/Asp 的核酸序列。22.根据权利要求21所述的引物的群体，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪劲，S塞维特，S林，秦晓丽，
申请(专利权)人：英特芒尼公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]