本发明专利技术公开了一种猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒２型多重ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光ＰＣＲ检测引物及方法，设计合成出引物，利用引物检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒２型的多重ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光ＰＣＲ检测方法，包括提取样品的ＤＮＡ后，利用ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光ＰＣＲ反应体系和ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光ＰＣＲ扩增程序对样品进行检测。本发明专利技术的有益效果是能够同时有效诊断和检测出猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒２型三种病毒，不能检测出非特异的猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒，有利于妊娠母猪繁殖障碍性病毒的鉴别与诊断，并且具有的较好敏感性、重复性和稳定性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种实时荧光PCR检测方法，具体涉及猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与 猪圆环病毒2型多重STOR Green I实时荧光PCR检测引物及方法。
技术介绍
猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCW)都能够不同程 度的导致妊娠母猪的繁殖障碍，引起母猪流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化及不孕 等，在猪群中具传播快、胚胎致死率高、流行范围广、传播途径多、病原体顽固等特点，每年 给养猪业造成了巨大损失。而且经常混合感染，靠中和试验和分离病毒来确诊容易造成假 阴性，而且操作繁琐，所需时间长，寻求一种操作简单、快速的检测、鉴别诊断方法是防制这 类疾病的基础。目前，针对以上三种病毒病的诊断方法有很多，这些方法具有操作复杂、费时费 力、敏感度差及阴性率高等缺点；临床已经使用的PCR诊断技术，虽然有灵敏度高、特异性 强、快速、简便等优点，但不能准确定量；基于TaqMan技术荧光定量PCR方法能定量，但是 成本较高，且需要合成特异性探针。亟需研究和开发简便、快速、特异、成本低、定量的检测 方法。STOR Green I是非特异性结合于双链DNA的荧光染料，可以和多种扩增序列结合。 SYBRGreen I实时荧光PCR检测方法可以不用设计和合成特异的荧光标记的探针直接扩增 检测任何基因的技术。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题设计与合成出猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒 2型引物后，利用引物用STOR Green I实时荧光PCR检测方法同时检测出猪伪狂犬病毒、猪 细小病毒与猪圆环病毒2型三种病毒。本专利技术的技术方案是猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型多重STOR Green I实时荧光PCR检测引物的序列如下猪圆环病毒2型引物的序列如下上游引物Pl 5' -TAA CTA CTC CTC CCG CCA TAC-3‘；下游引物P2 5' -GCC TAC GTG GTC TAC ATT TCC-3‘；猪细小病毒引物的序列如下上游引物P3 5' -TGG GAG GGC TTG GTT AGA-3‘；下游引物P4:5' -TGG TGG TGA GGT TGC TGA T-3'；猪伪狂犬病毒引物的序列如下上游引物Ρ5 5' -CGT GGA ACG AGC CCT TCA G-3'；下游引物P6 5' -AGA GCG GGT TGG CGA TGT-3‘。利用上述引物检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型的多重SYBRGreen I实时荧光PCR检测方法，包括提取样品的DNA后，按如下STOR Green I实时荧光 PCR反应体系和STOR Green I实时荧光PCR扩增程序对样品进行检测。所述STOR Green I实时荧光PCR反应体系，在25 μ 1体系中加入以下成份SYBR Green I PreMix 17 μ 1所述SYBR Green I实时荧光PCR扩增程序为95°C预变性5min ；进入循环，95°C 变性15s，55°C退火20s，72°C延伸20s，40个循环；反应结束后先加热至95°C，然后再降至 65°C，开始以0. 5°C /s递增至95°C检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线。本专利技术的有益效果是能够同时有效诊断和检测出PPV、PRV和PCV2三种病毒。能 最少检测出189拷贝猪伪狂犬病毒质粒、203拷贝猪细小病毒质粒和173拷贝猪圆环病毒 2型质粒，不能检测出非特异的猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒，有利于 妊娠母猪繁殖障碍性病毒的鉴别与诊断，并且具有的较好敏感性、重复性和稳定性，为PRV、 PPV.PCV2的检测提供了一种新的方法，可作为规模化猪场PRV、PPV、PCV2的净化检测方法， 建立无PRV、PPV、PCV2的猪群，同时也为PRV、PPV、PCV2感染的分子流行病学调查，研究PRV、 PPV、PCV2分子发病机制，早期诊断，诊断试剂盒的研制与开发，药物或疫苗的免疫机制提供 了试验依据和技术手段。附图说明图1为PRV gH基因质粒的PCR鉴定结果；图2为PPV VP2部分基因质粒的PCR鉴定结果；图3为PCV20RF2部分基因质粒的PCR鉴定结果；其中，图1，图2，图3中1.目的片段M. DL 2000Marker图4为多重STOR Green I荧光定量PCR反应溶解曲线；图5为多重STOR Green I实时荧光PCR反应特异性试验溶解曲线；图6为多重STORGreen I实时荧光PCR反应同一浓度重复性试验溶解曲线；图7为多重STOR Green I实时荧光PCR反应不同浓度重复性试验溶解曲线。具体实施例方式实施例猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型多重STOR Green I实时荧光PCR检 测引物的序列如下猪圆环病毒2型引物的序列如下上游引物Pl 5' -TAA CTA CTC CTC CCG CCA TAC-3'；下游引物P2 5' -GCC TAC GTG GTC TAC ATT TCC-3‘；PlP5P2 P6DNAddH20_0. 5+0. 5+0. 5 μ 1 0. 5+0. 5+0. 5 μ 1 1 + 1 + 1 μ 1 2μ 1猪细小病毒引物的序列如下上游引物P3 5' -TGG GAG GGC TTG GTT AGA-3‘；下游引物P4:5' -TGG TGG TGA GGT TGC TGA T-3'；猪伪狂犬病毒引物的序列如下上游引物Ρ5 5' -CGT GGA ACG AGC CCT TCA G-3'；下游引物P6 5' -AGA GCG GGT TGG CGA TGT-3‘。利用上述引物检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型的多重STOR GreenI实时荧光PCR检测方法，包括提取样品的DNA后，按如下STOR Green I实时荧光 PCR反应体系和STOR Green I实时荧光PCR扩增程序对样品进行检测。所述STOR Green I实时荧光PCR反应体系，在25 μ 1体系中加入以下成份SYBR Green I PreMix 17 μ 1Ρ1/Ρ3/Ρ50. 5+0. 5+0. 5 μ 1Ρ2/Ρ4/Ρ60. 5+0. 5+0. 5 μ 1DNA1+1+1 μ 1(MH2O2 μ 1_25 μ 1所述SYBR Green I实时荧光PCR扩增程序为95°C预变性5min ；进入循环，95°C 变性15s，55°C退火20s，72°C延伸20s，40个循环；反应结束后先加热至95°C，然后再降至 65°C，开始以0. 5°C /s递增至95°C检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线。上述实施例中，关于材料和方法如下1材料与方法1. 1 材料1. 1. 1毒株、细胞株和菌株PK-15细胞，猪伪狂犬病毒标准毒株均购自中国兽药监察所；猪细小病毒，猪圆环 病毒2型，猪繁殖与呼吸综合征病毒，猪瘟病毒和猪流感病毒标准毒株均购自河南省动物 性食品安全重点实验室；工程菌DH5ci感受态细胞购自大连宝生物工程有限公司。1. 1. 2常用溶液及培养基LB液体培养基；氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)贮存液，100mg/ml ；IPTG浓度为 100mg/ml ；X-g本文档来自技高网...
【技术保护点】
猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒２型多重ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ实时荧光ＰＣＲ检测引物，其特征在于：猪圆环病毒２型引物的序列如下：上游引物Ｐ１：５′－ＴＡＡ ＣＴＡ ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＣＧ ＣＣＡ ＴＡＣ－３′；下游引物Ｐ２：５′－ＧＣＣ ＴＡＣ ＧＴＧ ＧＴＣ ＴＡＣ ＡＴＴ ＴＣＣ－３′；猪细小病毒引物的序列如下：上游引物Ｐ３：５′－ＴＧＧ ＧＡＧ ＧＧＣ ＴＴＧ ＧＴＴ ＡＧＡ－３′；下游引物Ｐ４：５′－ＴＧＧ ＴＧＧ ＴＧＡ ＧＧＴ ＴＧＣ ＴＧＡ Ｔ－３′；猪伪狂犬病毒引物的序列如下：上游引物Ｐ５：５′－ＣＧＴ ＧＧＡ ＡＣＧ ＡＧＣ ＣＣＴ ＴＣＡ Ｇ－３′；下游引物Ｐ６：５′－ＡＧＡ ＧＣＧ ＧＧＴ ＴＧＧ ＣＧＡ ＴＧＴ－３′。
【技术特征摘要】
1.猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型多重STORGreen I实时荧光PCR检测 引物，其特征在于猪圆环病毒2型引物的序列如下 上游引物 Pl 5' -TAA CTA CTC CTC CCG CCA TAC-3‘； 下游引物 P2 5' -GCC TAC GTG GTC TAC ATT TCC-3‘； 猪细小病毒引物的序列如下 上游引物 P3 5' -TGG GAG GGC TTG GTT AGA-3‘； 下游引物 P4:5' -TGG TGG TGA GGT TGC TGA T-3'； 猪伪狂犬病毒引物的序列如下 上游引物 Ρ5 5' -CGT GGA ACG AGC CCT TCA G-3'； 下游引物 Ρ6 5' -AGA GCG GGT TGG CGA TGT-3‘。2.利用权利要求1所述引物检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型的多重 SYBR ...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏战勇，李明凤，陈红英，党玉丽，胡慧，崔保安，郭显坡，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：41
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