病毒融合抑制剂的胆固醇衍生物制造技术

本发明专利技术涉及包括Ｃ－末端连接于胆固醇或其衍生物的包膜病毒Ｉ型病毒促融合蛋白的ＨＲ２结构域中的至少十个连续氨基酸的化合物或其衍生物；或抑制病毒融合的其药学上可接受的盐。因此，本发明专利技术的化合物可用于预防或治疗由包膜病毒引起的疾病。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于抑制病毒融合的新化合物。“包膜病毒”，诸如正黏病毒、副黏病毒、逆转录病毒、黄病毒(flavivirus)、棒状 病毒(rhabdovirus)和甲病毒，被源于宿主质膜的脂双层包围(Ono和Freed，Adv. Virus Res.，2005，273，5419-5442)。该包膜含有介导受体结合以及病毒和宿主细胞膜之间融合的 糖蛋白。胆固醇和鞘磷脂经常富集于这些病毒脂双层中，特别是富集于它们质膜的富含脂 质的筏(raft)中(Aloia 等人，PNAS，1988，85，900-4 和 1993，90，5181-5)。在HIV-I中，最初作为高糖基化前体而合成的表面糖蛋白gpl60，被内切蛋白酶解 (endoproteolytically)切割为表面蛋白gpl20和跨膜蛋白gp41，其中表面蛋白gpl20通 过细胞表面受体 决定病毒趋性(tropism)，跨膜蛋白gp41负责膜融合过程(Moreno等人， Biochimicaet Biophysica Acta,2006,1758,111-123)。胆固醇占哺乳动物细胞质膜脂质含量的约30%。膜中的胆固醇和鞘脂经常从富含 甘油脂的双层周围被侧面隔离从而形成被称作“脂筏”的膜微结构域(P.Casey，Science, 1995，268，221-5)。许多跨膜蛋白和受体，包括作为HIV包膜gpl20主要受体的⑶4，特别地 富集于脂筏中。为了完成细胞和病毒内含物的融合和混合，gp41必须经历一系列复杂的、 明显地由gpl20附着于靶细胞的⑶4主要受体和CCR5或CXCR4共受体而触发的构象变化。共受体结合的完成导致病毒跨膜融合蛋白gp41的融合活性构象。gp41的胞外结 构域包含两个七肽重复区域HR1 (N-末端的近端)和HR2 (C-末端的近端)。疏水融合肽区 域插入到宿主细胞膜中，然而gp41的HRl区域形成三聚体卷曲螺旋(coiled coil)结构。 然后HR2区域在HRl卷曲螺旋的疏水沟(groove)内折叠回来，形成包含热力学稳定的六螺 旋束的发夹结构，它将病毒和细胞膜拉到一起以便融合(Matthews等人，Nature Reviews Drug Discovery，2004，3，215-225)。也已经表明，gp41与小窝蛋白(caveolirO-l相关，所述小窝蛋白-I是一组脂筏的 结构蛋白组分，被称作‘细胞膜穴样内陷(caveolae)，(Hovanession等人，Immunity，2004， 21,617-627)。小窝蛋白 _1 是胆固醇结合蛋白(Murata等人，PNAS，1995，92，10339-10343)， 因此胆固醇与HIV-I —起富集于细胞膜穴样内陷中。不管精确的机理如何，都有大量证据支持脂筏和胆固醇在包膜病毒进入中的重要 性，至少对HIV而言，通常认为宿主细胞质膜上的脂筏在介导gpl20/⑶4/共受体相互作用 中发挥重要的作用，而HIV病毒脂质双层中的胆固醇/脂筏对维持病毒糖蛋白的正常结构 和功能以及由此维持病毒的感染性而言是重要的(Ono和Freed，同前)。包含脂质锚的蛋白质是常见的。一种类型，最近已经对刺猬蛋白(Hedgehog proteins)进行了描述，涉及在自我剪接反应之后C-末端氨基酸被胆固醇分子酯化的蛋白 质(Tanaka Hall 等人，Cell，1997，91，85-97)。已经深入地研究了脂质锚将它们的相关蛋白质稳定地定位于脂质膜的相对能力。 疏水修饰和膜插入的稳定性之间存在这样的普遍关系准不可逆结合要求分子中存在两个 长链锚，例如棕榈酰基和法呢基(farnesyl)或十六烷基和法呢基(Barder等人，Nature, 2000，403，223-226)。相反，准不可逆结合是采用单个的胆固醇部分(moiety)达到的(Peters等人，PNAS, 2004，101，8531-6)。值得注意的是，这种修饰对通常经由不同脂质锚 定的蛋白质(N-Ras)而言是有效的。 将肽靶向于膜的普遍优点是有效地增加它的浓度超过大量水相。这导致它的亲和 力向膜结合的受体扩张。对将融合靶定为作用机理的抗病毒药而言，包括肽、蛋白质和抗体，许多实例证明 了将抑制剂锚定于膜的优点。特别是对Hiv而言，一种构建体(construct)，包括融合抑制 剂 T20(恩夫韦地(enfuvirtide)，Fuzeon :) (Matthews 等人，同前)、短接头(linker)和跨膜(TM)结构域，与缺乏TM结构域的相同构建体相比，是一种更强有力的抑制剂 (Egelhofer等人，J.Virol.，2004，78，568-575)。重要的是，在富含Trp的区域完全灭活游 离肽的突变，不降低锚定膜的肽的效力(Hildinger等人，J.Virol.，2001，75，3038-3042)。 相似地，包括gp41的TM结构域和并入脂质体的整个C-末端七肽重复的构建体具有有效的 抗病毒活性(Lenz 等人，J. Biol Chem.，2004，280，4095-4101)。将C-末端辛基添加于融合抑制剂T20诱导其抑制效力的显著增加。此外，辛基化 可挽救其他方式无活性的突变体的活性，其中C-末端残基GNWF被ANAA代替。该含C-末端 辛基的突变体表现出与野生型T20相似的效力。重要的是，辛基的位置是关键的，因为N-末 端衍生化对抗病毒效力没有影响(Peisajovich等人，J. Biol. Chem，2003，278，21012-7)。 最近已经提出了，增加的分配入膜的能力是支持第二代抑制剂T1249与T20相比增加的临 床疗效的原因(Veiga 等人，J. Am. Chem. Soc, 2004，126，14758-63)。趋化因子RANTES (HIV共受体CCR5的天然配体)的含疏水基团的N-末端伸展已 经被用于极大地增加抗病毒效力。蛋白质连接物的疏水性和化学性质对最大效力而言均是 重要的(Mosier 等人，1999，J. Viral, 1999，73，3544-50)。也已经表明了，当真正的非中和抗体(当其作为可溶蛋白产生时，不抑制HIV-I进 入)通过与跨膜锚定结构域的融合而被锚定于靶细胞的细胞表面时，它充当中和抗体的角 色(Lee 等人，J. Immunol.，2004，173，4618-26)。考虑到上述背景和分析，本专利技术的专利技术人提出将胆固醇部分作为脂质锚连接于来 自病毒促融合蛋白(fusogenic protein)的肽抑制剂。到那时为止，已经制成了胆固醇锚 定的HIV病毒融合抑制剂，它的效力是之前已知的任何HIV融合抑制剂效力的很多倍。因此，本专利技术提供病毒融合的抑制剂，其包括C-末端连接于胆固醇或其衍生物的 包膜病毒I型病毒促融合蛋白的HR2结构域中的至少十个连续氨基酸，或其衍生物；或其药 学上可接受的盐。例如，所述包膜病毒可为正黏病毒、副黏病毒、逆转录病毒、黄病毒、棒状病毒或甲 病毒。人们认为，所有这些病毒中的病毒融合以类似于HIV-I病毒融合机理的方式发生。因此，这些病毒中的每一种均具有HIV-I的HR2结构域gp41的等同物，它参与病 毒融合并可以类似于在此所示的抑制HI本文档来自技高网...

【技术保护点】
病毒融合抑制剂，其包括Ｃ－末端连接于胆固醇或其衍生物的包膜病毒Ⅰ型病毒促融合蛋白的ＨＲ２结构域中的至少十个连续氨基酸，或其衍生物；或其药学上可接受的盐。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：A佩西，E比安基，P因加利内拉，
申请(专利权)人：P安杰莱蒂分子生物学研究所，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]