呋喃妥因代谢物ＥＬＩＳＡ检测试剂盒制造技术

本实用新型专利技术涉及一种检测动物源性食品中呋喃妥因代谢物残留量的酶联免疫试剂盒。该试剂盒组成包括：９６孔酶标板、酶标二抗、呋喃妥因代谢物抗体浓缩液、７个浓度的标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、盖板膜、自封袋、说明书和质检报告。采用间接竞争ＥＬＩＳＡ方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中含有的呋喃妥因代谢物将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗呋喃妥因代谢物抗体，加入酶标二抗后，用ＴＭＢ底物显色，样本吸光度值与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中呋喃妥因代谢物的残留量。与仪器分析技术相比具有使用方便、高灵敏度等特点，可在动物源性食品中呋喃妥因代谢物的残留量检测中发挥重要作用。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本技术涉及检测呋喃妥因代谢物残留量的试剂盒，特别是检 测动物源性食品中呋喃妥因代谢物残留量的酶联免疫检测(ELISA)试剂盒，ELISA(Enzyme Linked ImmunosorbnentAssay)是酶联免疫吸附剂测定的简称，它是继免疫荧光和放射免 疫技术之后发展起来的一种酶免技术。( 二)
技术介绍
硝基呋喃类药物因有非常好的抗菌作用和药动力学的特性，曾经 被广泛应用，作为禽类、水产和猪促生长的添加剂。但在长时间的实验研究过程中发现，硝 基呋喃类药物和代谢物均可以使实验动物发生癌变和基因突变，正因为如此才导致此类药 物禁止在治疗和饲料中使用。呋喃妥因在1995年被禁用。由于硝基呋喃类药物在体内很快就能被代谢，而在组织中结合的代谢产物则能存 留较长的一段时间，所以在分析此类药物的残留时经常要分析其代谢后的产物，管理部门 就以检测代谢产物为手段达到检测硝基呋喃类残留的目的。呋喃妥因代谢产物AHD ；呋喃 它酮代谢产物AMOZ ；呋喃唑酮代谢产物AOZ ；硝基糠腙(呋喃西林)代谢产物SEM。用来检测呋喃妥因代谢物的最常用方法是LC-UV，LC-MS和LC-MS/MS。酶联免疫 方法结合了色谱技术，采用AHD衍生物的特异性抗体，具有很高的精确度和灵敏度，较低的 操作技术要求和短暂的检测时间，检测样本量大等特点在检测中很好的表现出来。(三)
技术实现思路
本技术所要解决的问题是提供一种小巧轻便的呋喃妥 因代谢物残留量检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需 要的技术含量不高，可进行一次连续多个样品中呋喃妥因代谢物残留量的测定，减少了检 测样本所需要的时间。本技术的技术方案是一种呋喃妥因代谢物ELISA检测试剂盒，包括盒体和 盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、15瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份 说明书和一份质检报告，其特征在于酶标板采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微 孔条上预包被呋喃妥因代谢物偶联抗原制成的检测板，15瓶试剂分别为-J瓶标准品溶液、 酶标二抗、抗体浓缩液、显色液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶 位共15个。酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆 装酶标反应微孔条有8个反应孔，放入真空铝箔袋中，盒体为硬纸盒，下凹瓶位由塑料泡沫 制成，以塑料硬膜为盖板膜，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致，将15瓶试剂用不同大 小、不同颜色的塑料瓶和玻璃瓶盛装并固定在下凹瓶位中与酶标板、盖板膜、自封袋、说明 书、质控报告一同封装在硬纸盒内，以便携带和运输。15瓶试剂分别为7瓶Iml梯度浓度的 标准品溶液、12ml酶标二抗、Iml抗体浓缩液、7ml显色液A液、7ml显色液B液、7ml终止液、 40ml浓缩洗涤液、50ml浓缩复溶液、15. Img2_硝基苯甲醛。每一个试剂盒中的试剂足够进 行96次测定(包括标准分析孔)，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开 多次检测。将剩下的放回铝箔袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。 检测时，样本中的呋喃妥因代谢物将和酶标板微孔条上预包被的呋喃妥因代谢物偶联抗原 竞争抗呋喃妥因代谢物抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与样本中所含呋喃妥因代谢物的残留量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得 出样品中呋喃妥因代谢物残留量，其操作简便易行。经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度，为0. 1 μ g/kg 组织、蜂蜜、牛奶样本检 测下限为0. 2μ g/kg、虾、鱼等水产组织样本检测限为0. 3μ g/kg ；水产、肌肉、肝脏组织 样本的回收率为75% 士 15% ；蜂蜜样本的回收率为90% 士 15% ；奶样的回收率为90% 士 10%。相对于其他呋喃妥因代谢物检测方法，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、氮 气吹干装置、涡旋仪、离心机、振荡机和微量加样器等，同类实验室一般均有配备，所需成本 较低。本技术的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于呋喃妥因代谢物残留量的检测。附图说明图1为本技术酶联板的侧面纵剖面图(长为8. 55cm)；图2为本技术酶联板的侧面横剖面图(长为12. 8cm)；图3为本技术酶联板的俯视图；图4为本技术盖板膜平面图；图5为本技术试剂瓶纵剖面平面图；图6为本技术固定泡沫模具的俯视图；图7为本技术盒体与固定泡沫模具的侧视图。参见附图酶标反应微孔条(2)预包被呋喃妥因代谢物偶联抗原(3)固定于酶标 板的外框支撑架(1)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置水浴 或恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条(2)，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；透明 帽的半透明PE塑料瓶(5)用于封装40ml浓缩洗涤液；蓝色帽的半透明PE塑料瓶(5)用 于封装50ml浓缩复溶液；白色帽(6)的白色PE塑料瓶(7)用于封装7ml显色液A液，红色 帽(6)的黑色PE塑料瓶(7)用于封装7ml显色液B液，黄色帽(6)的白色PE塑料瓶(7) 用于封装7ml终止液，红色帽的白色PE塑料瓶(8)用于封装12ml酶标二抗，绿色帽的白色 PE塑料瓶(8)用于封装7ml呋喃妥因代谢物抗体工作液，白色帽的棕色玻璃试剂瓶(9)用 于封装Iml/瓶的标准品溶液；泡沫塑料模具(10)有15个瓶位，放置位置依次为40ml浓 缩洗涤液瓶位(18)，50ml浓缩复溶液(11)，7ml显色液A液瓶位(14)，7ml显色液B液瓶位 (13)，7ml终止液瓶位(12)，Iml呋喃妥因代谢物抗体浓缩液瓶位(16)，12ml酶标二抗瓶位 (15)，7个Iml/瓶各种浓度的标准品溶液和；15. Img 2-硝基苯甲醛瓶位(17)，盒体为(19) 是硬纸盒。具体实施方式样本的前处理1.配液配液1 衍生化试剂向装有2-硝基苯甲醛的试剂瓶中加甲醇溶解定容至IOml (浓度为IOmM)。配液2 :C液0. 36M亚硝基铁氰化钠(Na2Fe (CN) 5 · NO · 2H20)溶液称取12. 5g水合亚硝基铁氰化钠加去离子水定容至100ml。D液(供奶样专用)IM硫酸锌(ZnSO4 · 7H20)溶液称取29. 8g硫酸锌用去离子水定容至100ml。配液3 :0. IM磷酸氢二钾溶液称取22. 8g三水合磷酸氢二钾加去离子水定容至1L。配液4: IM盐酸溶液量取8. 3ml浓盐酸加去离子水定容至IOOml。配液5: IM氢氧化钠称取4. Og氢氧化钠加去离子水定容至IOOml。配液6:甲醇-水溶液量取甲醇90ml加去离子水IOml混勻。配液7:复溶工作液用去离子水将2X浓缩复溶液按1 1体积比进行稀释(1份2X浓缩复溶液+1 份去离子水)用于提取样本的复溶，复溶工作液在4°C环境可保存一个月。配液8 洗涤工作液用去离子水将20X浓缩洗涤液按1 19体积比进行稀释(1份20X浓缩洗涤液 +19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4°C环境可保存一个月。2、肌肉、肝脏、水产(鱼虾等)组织前处理方法用均质器均质样本，取1. 0士0. 05g的均质物至50ml聚苯乙烯离心管中；加入5ml本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种呋喃妥因代谢物ＥＬＩＳＡ检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块９６孔的酶标板、一张盖板膜、１５瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于：酶标板是采用９６孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被呋喃妥因代谢物偶联抗原制成的检测板，１５瓶试剂分别为：７瓶标准品溶液、酶标二抗、抗体浓缩液、显色液Ａ液、显色液Ｂ液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共１５个。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：何方洋，余厚美，刘福林，蒲小容，何丽霞，王建霞，段盈盈，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，
类型：实用新型
国别省市：11[]