本发明专利技术描述了高通量发现蛋白的方法，所述蛋白在半胱氨酸残基处荧光标记，并且在与未结合的分析物结合时经历两种波长下的荧光比例的改变。本发明专利技术公开了在半胱氨酸残基处标记的探针，以及在半胱氨酸和赖氨酸处用两种不同的荧光团标记的探针。这些探针有效用于流体样品中疏水物质的表征和测量，特别是未结合的脂肪酸水平的表征和测量。可以确定个体的未结合的游离脂肪酸的谱型，其可以用来确定所述个体的疾病相对危险度。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利
涉及高通量发现在半胱氨酸残基处(探针)荧光标记的蛋白，所述在 半胱氨酸残基处(探针)荧光标记的蛋白在与未结合的分析物结合时经历两种波长下的荧 光比例变化，并且所述探针用来测量未结合的分析物的水平，所述未结合的分析物包括未 结合的游离脂肪酸和其它未结合的代谢物。相关领域描述为了本公开内容的目的，“分析物”是分子量约为2000Da以下的分子，并且未结合 的分析物是在水溶液中的这些分子。这些包括在人或动物生理或病理生理过程中天然存在 的代谢物和生理学重要的分子，和药物分子及其代谢产物，以及营养分子及其代谢产物。取 决于其溶解性，每种分析物级分在水溶液中作为单体存在(带电荷的或中性的)。该级分称 为“未结合的分析物”级分，并且包括未结合的代谢物(METu)。为了本公开内容的目的，“脂肪酸”，一种特定类型的代谢物，是1-30个碳原子的 未酯化的羧化烷基链，其可以作为中性(例如，质子化的、钠或钾盐)或离子物种存在，这取 决于水性介质的PH和条件。“游离脂肪酸(FFA) ”等价于脂肪酸，并且这两个术语是指所有 FFA，包括在水溶液中作为单体的那些和不处于溶液中的那些(例如，与其它大分子(蛋白、 膜)结合的)、细胞或部分FFA聚集物(胶束、皂和其它更复杂的聚集物)。在水溶液中作 为单体存在的FFA(带电荷的或中性的)称为“未结合的游离脂肪酸(FFAu) ”。为了本公开内容的目的，采用的术语“脂质”具有其通常和惯用的意思，并且定义 为在有机溶剂中最可溶而在水相中具有某种程度的溶解性水平(作为未结合的级分)的化 学化合物。因此，“脂质结合蛋白，，包括能够结合脂质的任何蛋白，所述脂质如本文所定义。未结合的分子的水平，诸如例如脂质、激素、和代谢产物，当在适当的人或动物流 体中测量时，可以提供健康和疾病的诊断信息。越来越明显的是，确定所述分子的未结合 (也叫作‘水相’或‘游离’)浓度提供关于生理平衡的重要信息。许多代谢物是疏水性分 子，其具有低水溶性和比其“总”浓度低得多的未结合的浓度，其中所述“总的”大部分可以 与蛋白或细胞结合。在生物流体中，通常调节未结合的分子的浓度以在正常生理条件下保6持相对恒定的未结合浓度。这种调节通过所述分子与载体蛋白诸如例如白蛋白的相互作用 而进行。因此，大部分所述分子通常与白蛋白或其它载体结合。然而，少部分分子可以与白 蛋白解离(并且重新结合)进入水相，并且这些是未结合的分子。胞内脂质结合蛋白(iLBP)是低分子量单链多肽家族。存在4种公认的亚族。亚 族I包含对维生素A衍生物如视黄酸和视黄醇特异的蛋白。亚族II包含具有针对胆酸、 类花生酸(eiconsanoids)、和血红素的特异性的蛋白。亚族III包含肠型脂肪酸结合蛋 白(FABPs)，并且亚族IV包含所有其它类型的脂肪酸结合蛋白(Haimerland，等(2004) Progress in LipidResearch(脂质研究进展)卷43 :328_349)。整个家族特征在于 共有的三维折叠。不同亚族的配体结合特性极大地重叠。亚族I (Richieri等(2000) Biochemistry (生物化学)39 7197-7204)和亚族II两族的野生型蛋白结合脂肪酸及其天 然配体。此外，单个氨基酸取代能够使亚族I和II蛋白的配体结合特性互换(Jakoby等 (1993) Biochemistry (生物化学)32 872~878)。美国专利号5，470，714和U. S. 6，444，432，其通过引用结合于此，描述了用于确定 未结合的游离脂肪酸(FFAu)的探针。这些探针使用来自iLBP家族的天然或突变形式蛋 白构建。如上文所讨论，该家族包括FABPs (Banaszak等(1994) Adv. Protein Chem.(蛋白 质化学进展)45 89-151 ；Bernlohr 等(1997) Ann. Rev. Nutrition (营养学综述年鉴)，17 277-303)。FABPs是分子量约为15kDa的胞内蛋白，并且具有结合1个或2个FFA的结合位 点ο为了本公开内容的目的，“探针”是在半胱氨酸残基处荧光标记的iLBPs，并且其在 与分析物结合时经历以两种不同波长测量的荧光指数比例的改变。探针还可以是在一个半 胱氨酸残基处用一种荧光团荧光标记且在另一个不同的残基处优选是赖氨酸残基处用不 同的荧光团荧光标记的iLBP，以便如果在与分析物结合时仅一种荧光团的荧光变化，则在 两种波长下的荧光指数比例是不同的。这样的探针可以用来确定特定的未结合的分析物的 水性浓度，所述特定的未结合的分析物包括FFAu，METu和其它亲脂性激素，和药物，否则由 于它们在水溶液中极差的溶解性特性，这是很难确定的。对于准确确定未结合的分析物的 胞内以及胞外浓度，荧光响应的比例变化是很重要的。然而，尽管蛋白结构和与目的配体的共同复合物结构是可以获得的，但是分子理 论的现有技术不足以从头设计具有任何所需特异性和敏感性的探针。因此，典型地需要大 量的实验，以找到不但以所需的特异性结合而且产生所需要的指示配体结合的信号比例变 化的蛋白探针。通过完全的随机诱变策略提高特异性和信号传导即使对于小蛋白如FABP 也是不切实际的，原因在于a)对于131个残基的FABP存在20131种可能的突变体，和b)筛 选甚至单个探针针对一定范围的METu和其它配体分子的结合特异性需要大量的时间进行 纯化、反应化学和探针荧光响应表征。因此，需要快速产生并且筛选数以千计所得到的突变体探针的方法。每种突变体 需要产生，并且以充足的量与荧光基团化学反应，从而使其敏感性和选择性能够测量多种 不同配体(也叫作未结合的分析物)。还重要的是，所述探针应该尽可能不含污染蛋白、未 反应的荧光团、以及任何其它可能干扰敏感性荧光测量的化合物。用于测量和比较探针对 配体的响应的快速、自动的方法的开发也是重要的。先前，将通过这些方法发现的在产生指示配体结合的信号比例变化中最有效的探针用6-丙烯酰-2-二甲氨基萘(acrylodan)主要在具有SEQ IDNO :2或SEQ ID NO :2或 SEQ ID NO 4的突变的大鼠肠FABP的27位赖氨酸处标记(Huber等Biochemistry (生物 化学)(2006)45 14263-14274和于2005年3月21日提交的美国申请号11/085，792，其通 过引用结合于此)。尽管在赖氨酸位置处用环境敏感的荧光团如6-丙烯酰-2- 二甲氨基 萘进行标记形成产生对配体结合敏感的荧光比例变化的探针，但是我们发现荧光团标记的 化学计量、标记的异质性以及荧光团-蛋白化学键的稳定性是突变体依赖性的。例如，SEQ ID NO 2或具有L72A置换的SEQ ID NO 2的6-丙烯酰_2_ 二甲氨基萘标记产生实质上完 全在单个赖氨酸位置(Lys 27)处标记的探针(例如图2)。然而，其它SEQ ID NO :2突变 蛋白(SEQ IDNO 4)的6-丙烯酰-2-二甲氨基萘标记可以形成不完全标记的和/或在多于 单个位置处被标记的探针(例如图3)。不完全标记的突变蛋白产生作为荧光标记的和未标记的突变蛋白的混合物的“探 针”。如先前所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于产生和筛选探针的高通量方法，所述方法包括下列步骤：（ａ）由多核苷酸模板产生编码包括各种ｉＬＢＰ突变蛋白的蛋白文库的多核苷酸突变体文库，所述多核苷酸模板编码包括半胱氨酸残基的ｉＬＢＰ或ｉＬＢＰ突变蛋白；（ｂ）表达由所述多核苷酸文库编码的ｉＬＢＰ突变蛋白；（ｃ）通过结合至固体基质而纯化所述ｉＬＢＰ突变蛋白；（ｄ）将所述基质结合的ｉＬＢＰ突变蛋白与单种荧光团或两种不同的荧光团缔合，以产生探针；（ｅ）由所述固体基质回收所述探针；（ｆ）在存在和不存在一组未结合的目的分析物的条件下，在荧光计中筛选回收的每种探针，从而确定每种探针与该组未结合的目的分析物的结合，所述每种未结合的目的分析物具有确定的未结合浓度；（ｇ）在存在和不存在所述未结合的分析物的条件下，观察在两种不同波长下测量的所述探针的荧光指数比例的改变；和（ｈ）依据所述每种探针针对该组目的分析物的一组荧光响应，表征所述每种探针，其中荧光团共价结合在所述半胱氨酸残基上。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：阿兰马克克莱费尔德，安德鲁亨利休伯，詹姆斯帕特里克坎普夫，托马斯科万，朱宝龙，
申请(专利权)人：FFA科学有限责任公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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