包含具有抗体Fc链的稳定、有活性人OB蛋白的结合物的组合物及方法技术

本发明专利技术涉及ＯＢ蛋白组合物和相关的方法。在此提供在生理ｐＨ下稳定并具有活性的ＯＢ蛋白悬浮液。上述ＯＢ蛋白悬浮液用于治疗或调节体重肥胖水平、糖尿病和其他病情。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及在高浓度和生理pH或接近生理pH条件下稳定、有活性的人OB蛋白组合物。还提供相关的组合物、制造方法和应用上述组合物的方法。
技术介绍
尽管肥胖的分子基础大体说来未知，但鉴别出的“OB基因”和所编码的蛋白(“OB蛋白”)给应用于调节机体脂肪沉积的机制投入了一些曙光。张等，自然372425-432(1994)；也见修改文章，自然374479(1995)。PCT公开号WO 96/05309，1996年2月22日出版，题目“体重调节剂，相应的核酸和蛋白，以及其诊断和治疗的用途”完整地公布了OB蛋白和相关的组合物及方法，在此引入仅作参考。人OB蛋白的氨基酸序列在WO 96/05309专利(在此引入仅作参考)的SEQ ID NOS4和6中(该出版公告的第172-174页)公布，成熟蛋白的第一个氨基酸残基在22位，是缬氨酸残基。成熟蛋白为146个残基(或者如果49位的谷氨酰胺缺乏为145个，SEQ ID NO6)。OB蛋白在ob/ob突变小鼠(小鼠肥胖是由于产生OB基因的产物缺乏)以及正常、野生型小鼠体内均具有活性。该生物学活性表明OB蛋白在诸多事件中，OB蛋白在体重减少中体现了其生物学活性。一般见，Barinaga，“肥胖”蛋白使小鼠苗条。科学269475-476(1995)和Friedman“体重控制的入门”自然385119-120(1997)。例如，已知在ob/ob突变小鼠中，施用OB蛋白导致血清胰岛素水平和血清葡萄糖水平的降低。也已知施用OB蛋白导致体内脂肪下降。该现象在ob/ob突变小鼠以及非肥胖的正常小鼠中均观察到。Pelleymounter等，科学269540-543(1995)，Halaas等，科学269543-546(1995)。也见Campfield等，科学269546-549(1995)(外周和中枢施用微克剂量的OB蛋白降低ob/ob和食物诱导肥胖的小鼠的食物吸收和体重，但在db/db肥胖小鼠中没有这些作用)。这些报道中没有观察到毒性，甚至在最高剂量下也没有。为制备给人体注射的药用组合物，已经观察到人该氨基酸序列在生理pH下相对高的浓度是不溶解的，例如每毫升液体大约超过2mg活性蛋白的浓度。在每公斤体重毫克蛋白的剂量范围，如0.5或1.0mg/kg/天或更低，可预期是给较大的哺乳动物如人注射用的治疗有效量。为避免大体积注射增加蛋白浓度是必要的，大体积会使患者不舒适或引起可能的疼痛。随着重组DNA技术的进展，在蛋白制剂中治疗用途的重组蛋白的可获得性也取得了进展。描述蛋白修饰和融合蛋白的综述文章见Francis，生长因子聚焦，34-10(1992)。上述的一种修饰是使用免疫球蛋白的Fc区。抗体包括功能上互相独立的二个部分，结合抗原熟知为“Fab”的可变结构域和熟知的“Fc”不变区结构域，不变结构域提供与效应器如补体或吞噬细胞连接的功能。免疫球蛋白Fc部分具有长血浆半衰期，而Fab是短寿的。Capon等，自然337525-531(1989)。用Fc结构域构建治疗蛋白提供较长的半衰期或掺入如Fc受体结合、蛋白A结合、补体固着和胎盘转移的功能，所有这些功能位于免疫球蛋白的Fc蛋白。同前，例如IgG1抗体的Fc区被融合到CD30-L的N-末端，CD30-L与CD30受体结合，CD30受体在霍金森氏病肿瘤细胞、退行性淋巴瘤细胞、T细胞白血病细胞和其他恶性细胞类型中表达。见美国专利号5,480,981。为了增加细胞因子短循环半衰期，抗炎和抗排斥的药物IL-10与鼠Fcγ2a融合。郑，X等，免疫学杂志，1545590-5600(1995)。研究还评价应用肿瘤坏死因子受体与人IgG1的Fc蛋白连接物治疗患败血性休克的病人。Fisher C等，新英格兰医学杂志，3341697-1702(1996)；Van Zee K.等，免疫学杂志，1562221-2230(1996)。Fc也和CD4受体融合以产生治疗爱滋病的治疗蛋白。见，Capon等，自然337525-531(1989)。另外，白介素2N-末端也与IgG1或IgG3的Fc区融合以克服白介素2的短半衰期和其循环毒性。见Harvill等，免疫技术195-105(1995)。对胰岛素来说，已经报道了其悬浮制备物。但应用胰岛素的那些病情，对可用于任何其他蛋白包括OB蛋白的那些病情没有预测性。胰岛素是一种相当小的蛋白，具有独特的物理和化学特性，这些特性对确定配制制剂的条件是重要的。Brange，Galenics的胰岛素，Springer-Verlag 1987描述了胰岛素悬浮液(p.36)；也见，Schlichtkrull等，具有延长效应的胰岛素制备物729-777页，在Hassellblatt等实验药理学手册新系列XXXII-1/2卷Springer-Verlag Berlin，Heidelburg，纽约(1975)。迄今为止，没有报道在生理pH下至少约2mg/ml浓度的人OB蛋白的稳定制备物，而更进一步，未见报道至少约50mg/ml或以上稳定浓度的活性人OB蛋白。再者，冷冻或冻干形式可用于改善自身稳定性，但比本专利技术描述的现成可用型悬浮液形式更不合乎需要。冷冻形式需要稳定冷冻温度下的贮存条件，由于用户级冰箱和冷冻器的去霜循环，稳定冷冻温度是不可能的。再者，冻干形式必须稀释和混合，是不方便的，可能损害病人的顺从性。从生产商的观点看，冷冻液的制造，贮存和船运花费昂贵，比现成可用型制剂的销售方式需要更多的监管工作。另外，为冻干制剂制造或否则制取可得到的合适稀释剂比不需要上述稀释剂的方法花费更多，并且效率更差。通过小体积注射传输含活性OB蛋白的人药用组合物的浓缩形式，一直来有需求。本专利技术完全满足这些需求。专利技术概述本专利技术源于以下观察，某些悬浮制剂允许在生理pH下至少大约2mg/ml的浓度制备稳定的OB蛋白。至于在此所用的术语“生理pH”指的是大约6.0至大约8.0的pH。应用上述组合物允许OB蛋白治疗药以相对小体积传输。正如本专利技术进一步披露的内容，沉淀药物的应用使得制备的人OB蛋白悬浮液具有如下特性1.与以溶液形式相同的人OB蛋白相比较，改善了在生理pH下的稳定性。在如下操作性实施例中阐明的是在10mg/ml或较高浓度的人OB蛋白悬浮液，当与溶液中允许溶解的最高pH下相同浓度相比较时(人OB蛋白的天然形式在pH4时溶解，这不是生理pH)，在pH7下具有较好的HPLC(高压液相层析)图谱。以下还阐明的是在大约pH7下浓度为5mg/ml的Fc-OB融合蛋白悬浮液，该结果显示与可比较的Fc-OB融合蛋白溶液相比的贮存条件下较少的降解产物。2.与溶液形式相同的人OB蛋白相比较持续的注射时间释放特征。下面的操作性实施例显示了，使用本专利技术高度浓缩的人OB蛋白悬浮液的持续释放效应。上述持续释放效应对该材料的活性维持相对较长的时期是有益的，因此与溶液中的人OB蛋白相比较具有相对较高的效力而需要注射的次数更少。因此，本专利技术的一个目的是一种在生理pH下活性人OB蛋白的稳定制备物，其具有的浓度至少大约2mg蛋白/ml。例如，提供一种浓度至少2.0mg/ml和pH为7.0的活性人OB蛋白稳定制备物。浓度的上限是对人施用有效的那种悬浮液形式，正如下面所述，操作性实施例提供在生理p本文档来自技高网...

【技术保护点】
ｐＨ大约６．０至大约８．０和浓度至少０．５ｍｇ／ｍｌ的人ＯＢ蛋白悬浮液，其中ＯＢ蛋白通过免疫球蛋白的Ｆｃ区连接到ＯＢ蛋白部分的Ｎ－末端衍生而成。

【技术特征摘要】
US 1997-4-17 08/843,971;US 1998-4-14 09/059,4671.pH大约6.0至大约8.0和浓度至少0.5mg/ml的人OB蛋白悬浮液，其中OB蛋白通过免疫球蛋白的Fc区连接到OB蛋白部分的N-末端衍生而成。2.权利要求1的人OB蛋白悬浮液，其中所述的Fc-OB蛋白的Fc部分选自(a)在SEQ ID NOS2和4给出的Fc氨基酸序列；(b)(a)的氨基酸序列，具有在1个或多个下列位置的不同氨基酸替换或缺失(参照SEQ ID NO2用的数字编号)(i)1个或多个半胱氨酸残基被丙氨酸或丝氨酸残基所取代；(ii)1个或多个酪氨酸残基被苯丙氨酸残基所取代；(iii)在第5位的氨基酸用丙氨酸取代；(iv)在第20位的氨基酸用谷氨酸取代；(v)在第103位的氨基酸用丙氨酸取代；(vi)在第105位的氨基酸用丙氨酸取代；(vii)在第107位的氨基酸用丙氨酸取代；(viii)在第1、2、3、4和5位的氨基酸缺失；(ix)1个或多个残基取代或缺失以消除Fc受体结合位点；(x)1个或多个残基取代或缺失以消除补体(C1q)结合位点；和(xi)i-x的组合；以及(c)(a)或(b)的氨基酸序列，其N-末端具有一个甲硫氨酰基残基。3...

【专利技术属性】
技术研发人员：DN布雷姆斯，DL弗伦奇，MA斯皮德，
申请(专利权)人：安姆根有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]