番红花的组织培养快速繁殖方法技术

本发明专利技术公开了一种番红花组织培养快速繁殖方法，该方法包括外植体灭菌、愈伤组织诱导、丛生芽诱导培养、不定芽继代培养和球茎诱导培养等步骤，最后诱导出球茎。本发明专利技术利用组织培养的方法，进行番红花愈伤组织及小球茎诱导，建立优系番红花的繁殖体系，进行种苗的工厂化育苗生产，能快速大量繁殖优系品种。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物的组织培养及繁殖方法，具体涉及。
技术介绍
番红花(Crocus sativus L.)又名藏红花、西红花，系鸢尾科(Iridaceae)番红花 属多年生草本植物。原产南欧各国及伊朗等地，后经印度转入西藏再传入中国，引种栽培成 功，故又名藏红花或西红花。由于番红花只是柱头入药，产量极低，采收耗时费力；同时种 源少，适宜栽培地区有限、条件苛刻等因素致使其价格昂贵，在被列为珍稀名贵中药材，并 被誉为植物黄金。番红花的雌蕊柱头是名贵中药，具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神之 功效，是传统的妇科、伤科良药。临床上还主要用于胃病、调经、麻疹、发热、肝脾肿大等的治 疗。尤其是近年来在治疗心脑血管疾病方面取得了较好的疗效。 由于番红花不能进行有性生殖，只能通过球茎进行无性繁殖，且栽培条件下其球 茎退化现象严重，导致种质资源严重缺乏。中国自引种以来，栽培番红花产量一直较低，远 远不能满足人们的需要。近年来组织培养技术在药用植物上得到了广泛的应用，这为繁殖 能力较差的名贵中药药用资源的保存和生产提供了新的途径。利用生物技术、组织培养的 方法进行种苗生产，在很多植物上已成为工厂化的商品生产，并带来了丰厚的经济效益。 因此，采用组织培养的方法，进行番红花愈伤组织诱导、丛生芽的诱导以及球茎的 再生，是探索快速、大量、持续地获得有效新生球茎的途径。利用组织培养的方法建立优系 番红花的繁殖体系，进行种苗的工厂化育苗生产，具有快速大量繁殖优系品种的优势，可以 解决番红花的种质资源质量问题。为了探索扩大种源的途径，采用组织培养技术进行了番 红花愈伤组织及小球茎诱导进行研究，以期为其种质资源的保存与利用奠定一定的基础。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，研究建立番红花无菌快繁体系，并提高增殖率， 适宜大规模生产优质种苗。 本专利技术提供一种番红花组织培养快速繁殖方法。 本专利技术利用组织培养的方法，进行了番红花愈伤组织及小球茎诱导，建立优系番红花的繁殖体系，进行种苗的工厂化育苗生产，快速大量繁殖优系品种。 本专利技术所述方法包括下列步骤 (1)外植体灭菌将球茎用水洗净，除去皮膜，置于超净工作台上消毒接种；先于70%酒精中漂洗30-40秒，再用0. 1% HgCl2消毒8-10分钟，最后用无菌水冲洗4 5次，彻底洗去残余的HgCl^将消毒后的球茎切成1-1. 5cm 接种于培养基上； (2)愈伤组织诱导将经过消毒灭菌后的上述球茎在无菌环境中接种于诱导培养基MS+0. 5mg/L NAA+5. 0mg/L 6-BA培养基上中，培养20天收获愈伤组织； (3)丛生芽诱导培养将愈伤组织接种到MS+0. 5mg/L NAA+2. Omg/L 6-BA培养基上，20天后在黑暗条件(24h无光照)下，2(TC培养，可诱导出大量丛生芽； (4)不定芽继代培养将丛生芽切割成单个芽后转接到MS+0. 5mg/LNAA+2. Omg/L6-BA培养基上，在黑暗条件下，20士2t:培养，15天后芽长到2-3cm ; (5)球茎诱导培养当芽高2-3cm时转接到MS+0. 5mg/L NAA+3. Omg/L 6-BA培养基，在光照条件(光照时间12h/d，光照强度1500 20001x)下诱导出球茎。本专利技术方法所述培养基MS、 NAA和6-BA均可从市售得到。 本专利技术方法基于下列试验研究，其结果如下 (一)方法 (1)外植体灭菌将球茎用水洗净，除去皮膜，置于超净工作台上消毒接种；先于70%酒精中漂洗30-40秒，再用0. 1% HgCl2消毒8-10分钟，最后用无菌水冲洗4 5次，彻底洗去残余的HgCl^将消毒后的球茎切成1-1. 5cm 接种于培养基上； (2)愈伤组织诱导将经过消毒灭菌后的上述球茎在无菌环境中接种于诱导培养基MS+0. 5mg/L NAA+5. Omg/L 6-BA培养基上中，在黑暗条件(24h无光照)下培养；考察了MS、 B5、 White三种不同培养基对番红花愈伤组织诱导率的影响，不同植物生长调节剂和光照条件对番红花愈伤组织诱导和生长的影响。 (3)丛生芽诱导培养将愈伤组织接种到不同浓度激素配比的MS培养基上，用于 诱导丛生芽；考察光照和温度条件对诱导丛生芽的影响。 (4)不定芽继代培养将丛生芽切割后转接到不同浓度激素配比的MS培养基中， 进行芽增殖实验。考察光照和温度条件对不定芽增殖的影响。 (5)球茎诱导培养当芽高2-3cm时进行球茎诱导实验。将丛生苗转接到不同浓 度激素配比的MS培养基中，分别在光照和黑暗条件下诱导球茎。 (二)结果 1.外植体灭菌灭菌时间短，外植体边缘褐化程度轻，但污染率较高；灭菌时间太 长，污染率较低，但外植体会被灼烧，大多数不能形成愈伤组织。经步骤1方法灭菌的番红 花球茎消毒效果好，能形成愈伤组织。2.愈伤组织诱导MS为适宜的诱导愈伤组织培养基(见表1)，不同浓度激素配比 中，以MS+0. 5mg/LNAA(萘乙酸)+5. Omg/L 6_BA(6-苄氨基腺嘌呤)为宜(见表2)。黑暗条 件下(24h无光照)有利于愈伤组织的生长(见表3)。 表1不同培养基对愈伤组织诱导的影响 <table>table see original document page 4</column></row><table> 表2不同激素配比对愈伤组织生长的影响 <table>table see original document page 5</column></row><table> 表3光照条件对愈伤组织诱导的影响 <table>table see original document page 5</column></row><table> 3.丛生芽诱导培养经过30天的培养，部分培养基中愈伤组织分化成芽。其中， 以MS+O. 5mg/LNAA+2. 0mg/L6-BA培养基长芽的时间较短，且生长速度较快。愈伤组织分化 出小芽，幼芽数逐渐增多形成芽丛。进行了光照条件对丛生芽的诱导，结果表明黑暗条件下 可诱导出大量丛生芽，而光照条件不利于愈伤组织分化成芽。温度过高不利于诱导丛生芽， 适宜温度为20±2°C。 4.不定芽继代培养在2. 0mg/L6-BA (6_节氨基腺嘌呤)的MS培养基上，改变NAA 的浓度，对幼芽的继代增殖影响较大。不加NAA(萘乙酸)时，形成的丛芽数较少，但所形成 的幼芽节间较长，且容易再次继代。NAA浓度大于1. Omg/L时，形成的丛芽数较多，且芽较瘦 弱不利于再次继代，NAA浓度越大，所形成的幼芽越短，苗高也逐渐降低，基部形成的愈伤组 织块逐渐增大。其中仍以MS+0. 5mg/LNAA+2. 0mg/L6_BA培养基芽增殖效果为好。进行了光 照条件对丛生芽的增殖，结果表明黑暗条件丛生芽能够增殖，而光照条件不利于丛生芽增 殖。温度过高不利于丛生芽增殖，适宜温度为20士2t:。 5.球茎诱导培养将丛生苗转接到不同浓度激素配比的MS培养基中，MS+O. 5mg/ LNAA+3. 0mg/L6-BA培养基诱导出球茎所需时间短，且球茎生长快本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种番红花组织培养快速繁殖方法，其特征在于该方法包括下列步骤：（１）外植体灭菌：将球茎用水洗净，除去皮膜，置于超净工作台上消毒接种；先于７０％酒精中漂洗３０－４０秒，再用０．１％ＨｇＣｌ↓［２］消毒８－１０分钟，最后用无菌水冲洗４～５次，彻底洗去残余的ＨｇＣｌ↓［２］，将消毒后的球茎切成１－１．５ｃｍ↑［３］，接种于培养基上；（２）愈伤组织诱导：将经过消毒灭菌后的上述球茎在无菌环境中接种于诱导培养基ＭＳ＋０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ＋５．０ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ培养基上中，培养２０天收获愈伤组织；（３）丛生芽诱导培养：将愈伤组织接种到ＭＳ＋０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ＋２．０ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ培养基上，２０天在黑暗条件下，２０℃培养２０天，诱导出丛生芽；（４）不定芽继代培养：将丛生芽切割成单个芽后转接到ＭＳ＋０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ＋２．０ｍｇ／Ｌ　６－ＢＡ培养基上，在黑暗条件２４小时无光照下，２０±２℃培养，１５天后芽长到２－３ｃｍ；（５）球茎诱导培养：当芽高２－３ｃｍ时转接到ＭＳ＋０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ＋３．０ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ培养基，在光照条件下诱导出球茎。

【技术特征摘要】
一种番红花组织培养快速繁殖方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)外植体灭菌将球茎用水洗净，除去皮膜，置于超净工作台上消毒接种；先于70％酒精中漂洗30-40秒，再用0.1％HgCl2消毒8-10分钟，最后用无菌水冲洗4～5次，彻底洗去残余的HgCl2，将消毒后的球茎切成1-1.5cm3，接种于培养基上；(2)愈伤组织诱导将经过消毒灭菌后的上述球茎在无菌环境中接种于诱导培养基MS+0.5mg/L NAA+5.0mg/L 6-BA培养基上中，培养20天收获愈伤组织；(3)丛生芽诱导培养将愈伤组织接种到MS+0.5mg/L NAA+2.0mg/L 6-BA培养基上，20天在黑暗条件下，20℃培养20...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦路平，汪洋，杨弘，宋嬿，
申请(专利权)人：上海华宇药业有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]