ＨＣＶ基因分型ＤＮＡ微阵列芯片制造技术

本发明专利技术涉及一种ＤＮＡ微阵列芯片，特别是涉及丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因分型ＤＮＡ微阵列芯片。本发明专利技术采用固相载体基片，针对ＨＣＶ不同基因型设计寡核苷酸探针，制备成ＤＮＡ微阵列芯片，再配以ＰＣＲ引物以及其它组分，可以快速准确对血液样品中丙型肝炎病毒进行分型。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种DNA微阵列芯片，特别是涉及丙型肝炎病毒(HCV)基因分型DNA 微阵列芯片。本专利技术采用固相载体基片，针对HCV不同基因型设计寡核苷酸探针，制备成 DNA微阵列芯片，用于快速准确对血液样品中丙型肝炎病毒进行分型检测。
技术介绍
丙型肝炎是严重危害人类健康、流行范围广泛的传染病，其病原体为丙型肝炎病毒 (hepatitis C virus, HCV)。目前，全球有超过1.7亿人感染HCV，其中每年有超过IO万例 HCV患者发展为肝癌，进而出现消化道出血及腹水。根据WHO 2002年年报，在2001年， 慢性肝病引起1,400万例死亡，包括79.6万例由肝硬化引起、61.6万例由原发性肝癌引起。HCV是正性单链RNA黄病毒，包括9，400左右个核苷酸。HCV基因组具有一个单独的开放 阅读框，基因结构由5，-NCR-C-El-E2-NSl-NS2-NS3-NS4-NS5-N-CR-3，组成，编码一具有3,010 个氨基酸的多聚蛋白体，翻译后被分为病毒复制和病毒粒形成所必须的结构和非结构蛋白。 HCV具有高度的变异性(其变异率高达1.4-1.9X10力核苷酸/年)和本身具有负选择作用的特 征，高突变是由于复制酶无校正功能；易误性RDRP(error-proneRDRP，EP-RDRP)的存在以及 正选择作用等原因。而其本身具有负选择作用又表现为病毒基因组中各种基因结构及功能 不同，有些区域高度保守。根据全世界不同地区分离的HCV不同株的全部或部分基因组的系 统进化分析，目前HCV可以分成1 6型共六个型别，各型又分亚型，HCV亚型已经超过50个， 其中最常见的是la，lb，2a，2b,3a,6a,各型核酸序列之间相差31—34%，氨基酸序列相差大约30 %，而亚型序列之间相差约20_23%。有几种HCV病毒株主要从东南亚被分离出，被命名为 HCV7， 8， 9， 10， ll型，除了HCV10a型(目前被列入HCV3型)，由于其系统进化上的相似 性，其余各型被列入HCV6型。研究表明，HCV不同型别之间对干扰素治疗的敏感度不一，特别是l型较其它型别敏感 度尤为差。不同型别HCV感染性肝炎，其急性、慢性的中度及重度、肝炎后肝硬化及原发性 肝癌发生率都有不同，HCV基因型与丙型肝炎患者临床病情及其严重程度密切相关。目前对HCV基因分型方法主要有限制性长度多态性(RFLP)，型特异性引物PCR，型 特异性探针核酸杂交分析，RDB，直接测序等方法，但是这些方法大多存在操作繁琐，检测 时间长，通量低，还存在灵敏度低，特异性不高等缺点。本专利技术采用基因芯片技术，由于该4技术可以将极其大量的HCV分型探针同时固定于支持物上，制备成HCV基因分型DNA微 阵列芯片，所以本芯片可以一次性对多个样本中的HCV进行准确分型，从而解决了传统方法 的不足。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题是，克服现有技术的缺陷和不足，制造具有高通量、高准确性 的DNA微阵列芯片，可以一次性对多个样本中HCV进行准确分型检测。因此，本专利技术的目的是制备一种丙型肝炎病毒(HCV)基因分型画A微阵列芯片，以满足 大量血液样品进行HCV快速准确分型的需要。为此，本专利技术采用以下技术方案采用固相载体基片，针对HCV不同基因型设计的特异 性寡核苷酸探针，制备成DNA微阵列芯片，再配以RT-PCR系统，使得每张芯片可以一次性同 时检测多个样本的HCV基因型。根据本专利技术一个优选的实施方案，针对HCV不同型别的基因序列，设计一套特异性寡核 苷酸探针(见表l)，采用自动点样机器人，将探针印制在一张玻片的特定区域，每张玻片印 制10个微阵列矩阵，这样就制成DNA微阵列芯片， 一张芯片可以检测8份样本。根据本专利技术另一个优选的实施方案，在上述的DNA微阵列芯片的基础上再配以其它必 要的组份，如PCR引物(见表2)，即组成完整的产品。在实际检测时，取8份人基因组DNA 溶液，采用CY3标记引物和不对称PCR方法，扩增出可能存在的HCV基因组CY3标记靶 标片段。取DNA微阵列芯片一张，在8个杂交区分别加入8种PCR产物2ul和杂交液8ul， 同时在阳性和阴性对照区加入参照产物溶液，将芯片放在自动杂交洗涤仪的杂交槽内，杂交 温度5(TC,杂交时间40分钟，自动洗涤吹干。取出玻片，放入GeriePix 4100A扫描仪进行 扫描，使用分析软件对扫描图像信号进行图像数据转换处理，并分析产生样本HCV型别结果。根据本专利技术另一个优选的实施方案，DNA微阵列芯片的片基载体可以是玻片、尼龙膜或 其它可以附着探针的载体。表l寡核苷酸探针序列以及所检测的型别<table>table see original document page 5</column></row><table><table>table see original document page 6</column></row><table>附图说明图1 HCV基因分型DNA微阵列芯片1芯片整体外观(示意图)2杂交区以及探针微阵列(示意图) 图2 HCV微阵列探针排列示意图其中HP为阳性对照探针；HN为阴性对照探针 图3 1型HCV病毒样本检测结果扫描图(示意图) 图4 2型HCV病毒样本检测结果扫描图(示意图) 图5 3型HCV病毒样本检测结果扫描图(示意图) 图6 6型HCV病毒样本检测结果扫描图(示意图)具体实施例方式下列实施例旨在举例说明而不是限制本专利技术。实施例1: HCV基因分型DNA微阵列芯片PCR引物和探针的设计在HCV基因组中5'UTR区设计RT及PCR引物，采用不对称RT-PCR体系，扩增分型 所需要的目标片段；在目标片段范围内，设计1型探针3条，2型探针4条，3型探针3条， 6型探针三条和通用探针1条。实施例2: HCV基因分型DNA微阵列芯片的制备采用基因芯片自动点样仪，将14条分型探针和2条对照探针点制到玻片的特定区域，制 成DNA微阵列。(1) 点样探针溶液将探针稀释到5XSSC、 0.05。/。SDS溶液中，终浓度为30nM;(2) 点样矩阵将探针点制在玻片上，每个探针横向重复2点点制在杂交区内，每行 8点，共4行，32个点(参见附图l);杂交区分成10个区，可以同时检测8份 样本(9， IO杂交区为对照区)。实施例3:使用本专利技术产品检测8份临床样本取8份临床样本和阴、阳性对照各一份，提取RNA，按照RT-PCR试剂操作说明，进行 PCR扩增，获得DNA杂交模板。采用本专利技术的HCV基因分型DNA微阵列芯片，对以上样本进行一次性检测。取一张微阵列芯片，分别取10管PCR产物各2ul加到芯片的10孔，再在各孔加入杂交 液(5xSSC) 8ul，芯片放到自动杂交洗涤仪的槽内，设定杂交温度5(TC，杂交时间40分钟。 杂交后自动洗涤和风干。采用GenePix 4100A扫描仪，扫描杂交信号，得到杂交结果扫描图，并将图像转换成数据。采用分析软件，将以上数据自动分析转换成为各个样本的基因型别，同时，将8份样本 DNA测序，作为检测结果对照。结果表明，8份样本检测结果与样本测序结果完全相符本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＤＮＡ微阵列芯片，采用ＤＮＡ微阵列芯片技术，对ＨＣＶ进行基因分型检测，其特征在于将一组ＨＣＶ不同基因型特异性寡核苷酸探针，点制在载体上，制成ＤＮＡ微阵列芯片，再配以ＲＴ－ＰＣＲ引物以及其它组分，组成完整的试剂盒。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：彭春梅，张帆，胡守旺，李明，何蕴韶，
申请(专利权)人：中山大学达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]