筛选环境胁迫诱导型启动子的方法及该方法获得的启动子技术

本发明专利技术公开了一种筛选环境胁迫诱导型启动子的方法及该方法获得的启动子。本发明专利技术所提供的筛选环境胁迫诱导型启动子的方法，是将环境胁迫处理前后的目的植物的总ＲＮＡ反转录为ｃＤＮＡ，再将所述ｃＤＮＡ作为探针与所述目的植物基因表达微阵列进行杂交；将与环境胁迫处理前相比杂交信号增加２倍或２倍以上的ｃＤＮＡ探针所结合的所述目的植物基因表达微阵列上的核苷酸序列，与所述目的植物的基因组ＤＮＡ进行分析，得到环境胁迫诱导型启动子。利用该方法成功地从水稻中克隆了包括ＤＬ２、ＤＦＬ４、ＤＦ１５、ＤＦ２和ＤＬ５在内的诱导型启动子９６个。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种筛选环境胁迫诱导型启动子的方法及该方法获得的启动子。
技术介绍
干旱和盐渍土是当今世界上严重影响农作物生产的两个主要因素。为了提高受影响区域的农业生产力，不管是传统育种还是农作物基因工程都在设法提高作物的耐旱性和抗高盐性。了解植物逆境压力在基因水平上的反应可为将来的育种和基因工程提供必要的基础。最近在对拟南芥干旱和高盐压力反应的研究暗示了很大比例的基因牵涉到对干旱或高盐压力的反应。在一些案例中，显示出单个基因表达水平的改变会在很大程度上影响植物对干旱和高盐压力的反应。对受干旱和高盐条件控制的基因的鉴定有极大的意义；另外，它还有助于对逆境诱导启动子和组织特异性启动子的鉴定，对农作物基因工程的运用都起着重要的作用。DNA微阵列提供了对基因表达分析进行大批量处理的手段，已经被运用于几种植物种类对干旱和高盐压力的反应的基因表达的图形进行研究。最初，利用一个摘自拟南芥的含有1300个全长型cDNA克隆的微列阵对干旱压力和冷压力的基因表达进行研究。这个研究分别鉴定出44和19个cDNA克隆，它们都是干旱和冷可诱导基因。其他研究采用一个拟南芥的含有大约7000个全长型cDNA克隆的微列阵去描绘对于abscisic acid(ABA)处理，还有冷、干旱、高盐压力反应的基因表达。还有的研究采用了一个含有大约8100个拟南芥基因的Affymetrix GeneChip来临控基因表达在盐、渗透和冷压力下的变化；这个研究揭示了根基因表达的变化和叶基因表达的变化有很显著的不同，仅有微小的重叠。类似的研究，还有利用一个含有1463个DNA元件的微列阵来评估大麦对干旱、高盐反应的基因表达。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种筛选环境胁迫诱导型启动子的方法及该方法获得的启动子。本专利技术所提供的筛选环境胁迫诱导型启动子的方法，是将环境胁迫处理前后的目的植物的总RNA反转录为cDNA，再将所述cDNA作为探针与所述目的植物基因表达微阵列进行杂交；将与环境胁迫处理前相比杂交信号增加2倍或2倍以上的cDNA探针所结合的所述目的植物基因表达微阵列上的核苷酸序列，与所述目的植物的基因组DNA进行分析，得到环境胁迫诱导型启动子。所述目的植物基因表达微阵列(芯片)可从商业途径获得，如安捷伦(Agilent)科技有限公司公司、Affymetrix出售包括水稻、拟南芥等在内的多种植物的基因表达微阵列；所述目的植物基因表达微阵列也可按照常规方法构建，如文献《DNA芯片实验操作指南》(韩金祥，等编译.山东大学出版社，2001)等。其中，所述环境胁迫包括干旱胁迫、盐胁迫和冷胁迫等由环境因素引起的水分胁迫。所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，如农作物水稻、小麦、玉米、烟草、矮牵牛、茄子、番茄、曼陀罗、西瓜、甜瓜、黄瓜、黄豆、绿豆、豌豆、豇豆和紫藤等。所述目的植物的总RNA可来源于胁迫处理前或胁迫处理后植物材料的RNA。所述目的植物的总RNA可为相同或不同组织和/或器官的总RNA。所述方法中还可包括将得到的环境胁迫诱导型启动子转化到植物中进行报告基因表达鉴定的步骤。本专利技术所提供的利用上述方法筛选到的启动子，其核苷酸序列是如下1)、2)、3)、4)或5)1)序列表中的序列1或在严格条件下与所述序列表中的序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；2)序列表中的序列2或在严格条件下与所述序列表中的序列2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；3)序列表中的序列3或在严格条件下与所述序列表中的序列3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)序列表中的序列4或在严格条件下与所述序列表中的序列4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；5)序列表中的序列5或在严格条件下与所述序列表中的序列5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。序列表中的序列1由1301个脱氧核苷酸组成，该启动子的名称为DF2。序列表中的序列2由1301个脱氧核苷酸组成，该启动子的名称为DF15。序列表中的序列3由1244个脱氧核苷酸组成，该启动子的名称为DFL4。序列表中的序列4由1304个脱氧核苷酸组成，该启动子的名称为DL2。序列表中的序列5由1300个脱氧核苷酸组成，该启动子的名称为DL5。本专利技术筛选环境胁迫诱导型启动子的方法流程如图1A所示，该方法首先采用微阵列法(Microarray)取得在指定压力条件下的特定组织的基因表达概貌，选取候选启动子，然后对候选启动子进行植物转化和基因表达鉴定。传统的分离环境胁迫诱导性启动子的方法流程如图1B所示。本专利技术的方法与传统方法相比具有以下优点1、结合了微阵列法进行启动子的分离首次将微阵列法用于启动子的分离。人们一般只用微阵列法研究基因的表达情况，研究环境胁迫引起基因表达的差异性，研究基因表达的组织特异性，未有人将微阵列法用于环境胁迫诱导性启动子的分离。2、启动子分离的高通量性本专利技术方法一次可以分离上百个受环境胁迫诱导的启动子。由于微阵列法研究基因表达的高效性，一次可以对上万个基因表达情况进行研究，从中发现数百甚至上千个受环境胁迫诱导的基因，因此可以一次分离几十个或上百个候选的环境胁迫诱导的启动子。3、启动子分离的高效性由于微阵列法的仪器化程度很高，所以杂交用时很短也很方便，所以用新方法分离启动子很方便快捷。3、与组织特异性启动子分离相结合由于微阵列法不仅提供了基因表达的诱导性情况，同时也提供了基因表达组织特异性信息，所以用本专利技术方法分离的启动子不仅是环境胁迫(如干旱或高盐)诱导的，而且还可以知道启动子的组织特异性。利用本专利技术的方法筛选到的干旱诱导启动子DL2、DFL4、DF15、DF2和DL5，其中DL2在普通叶具有明显的诱导现象；DFL4和DF2在普通叶具有明显的诱导现象；DF15和DL5在普通和旗叶中都有明显的诱导现象。本专利技术以水稻为实例证实了本专利技术筛选环境胁迫诱导型启动子的方法的可行性、高通量和实用性。利用本专利技术筛选环境胁迫诱导型启动子的方法成功地从水稻中克隆了包括DL2、DFL4、DF15、DF2和DL5在内的诱导型启动子96个。附图说明图1A为本专利技术筛选组织特异性启动子的方法流程图；图1B为传统的分离干旱和高盐诱导性启动子的方法流程图；图2为干旱处理植株D1、D2和D3期的照片；图3为籼稻品种明恢63的旗叶、普通叶和小穗的cDNA探针与微阵列的杂交情况；图4为重组载体pCAMBIA1303/inducible promoter T-DNA区的图谱；图5为干旱诱导启动子的RT-PCR电泳图谱；具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。本专利技术的筛选组织特异性启动子的方法，可用于筛选各种启动子，下面以水稻为例阐明新的高通量分离干旱诱导性启动子的方法实施例1、从水稻中筛选干旱诱导组织特异性启动子本实施例中采用了一个覆盖36，926单一基因或基因模型的70mer寡聚体水稻基因表达微阵列，来测试水稻叶在干旱压力环境下基因表达的变化。该水稻基因表达微阵列按照文献《Conservation and divergence of light-regulated genomeexpression patterns during se本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种筛选环境胁迫诱导型启动子的方法，是将环境胁迫处理前后的目的植物的总ＲＮＡ反转录为ｃＤＮＡ，再将所述ｃＤＮＡ作为探针与所述目的植物基因表达微阵列进行杂交；将与环境胁迫处理前相比杂交信号增加２倍或２倍以上的ｃＤＮＡ探针所结合的所述目的植物基因表达微阵列上的核苷酸序列，与所述目的植物的基因组ＤＮＡ进行分析，得到环境胁迫诱导型启动子。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邓兴旺，夏勉，王喜萍，翟晨光，刘敏，
申请(专利权)人：北京凯拓迪恩生物技术研发中心有限责任公司，
类型：发明
国别省市：11[]