本发明专利技术涉及小麦黄矮病毒的多重ＰＣＲ检测的引物组和试剂盒，引物组由如下三对引物ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ．１－６组成，试剂盒包含三对引物ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ．１－６，还包含进行多重ＰＣＲ反应的试剂：浓度为０．４×－０．９×的缓冲液；浓度为０．１－０．５ｍＭ的ｄＮＴＰｓ；浓度为１．０－３．５ｍＭ的Ｍｇ２＋，应用本发明专利技术的引物组和试剂盒进行多重ＰＣＲ反应检测小麦黄矮病对田间复合侵染的小麦材料检测具有快速、省时、节约成本等优势。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物病毒学
，特别是涉及小麦黄矮病毒的多重PCR检测的引 物组和试剂盒。
技术介绍
小麦是全世界最主要的粮食作物之一，我国的种植面积居世界首位。但是，病毒病 及其它病害严重影响了小麦的产量和质量。大麦黄矮病毒病(Barleyyellow dwarf virus, BYDV)是一种全球性的病毒病害。每年对世界粮食生产造成一定程度的危害，大发生时会 造成严重减产。在我国，该病主要流行于北方麦区，引起的小麦黄矮病是重要的流行病害。 1987年仅陕西和甘肃两省就因该病害的流行损失5亿多公斤小麦，1998年大面积流行发生 范围遍及陕西、山西、宁夏、内蒙和河北等多个省(自治区)。为了保证小麦生产的产量和质 量，准确鉴定小麦病害，了解其流行动态，以尽早做好防范措施。因此小麦生产上急需一种 较为灵敏、准确和快速的病害检测方法。早期的检测方生物学、血清学、电镜观察、核酸杂交和PCR技术都先后用于检测 小麦病毒，但是一些传统的检测方法灵敏度不是很高，而且都只针对单一病毒的检测，对多 种病毒混合检测时，需要耗费较多的时间和试剂。多重PCR(M-PCR)是在普通 PCR(polymerase chain reaction)的基础上加以改 进，于一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域 扩增多个目的片段的PCR技术。与常规的单一 PCR相比，多重PCR可以同时检测多种病害， 极大地提高检测效率，降低检测成本。目前国内有单重和荧光PCR检测BYDV-PAV、GPV、GAV， 而在田间经常表现为多种病害复合侵染；并且其症状极其相似，需要用分子方法进行区分。 利用单一 PCR对多种病毒进行系统检测的工作量较大，因而多重RT-PCR在小麦病害的检测 中的优越性更为明显。
技术实现思路
本研究针对我国小麦病害发生的现状，利用设计的特异性引物对，摸索和优化多 重PCR反应体系的条件参数等，建立了能从小麦叶片组织中同时检测BYDV种群PAV、GPV, GAV三种病毒的复合侵染田间样品的多重PCR检测的引物组和试剂盒。具体的，本专利技术提供了一种利用多重PCR反应同时检测小麦黄矮病种群中PAV、 GPV, GAV三种病毒的引物组，该引物组由如下三对引物组成第一对引物为PAV正反向引物SEQ ID NO. 1 :5，-ATGAATTCAGTAGGCCGTAGG-3，(PAV F)SEQ ID NO. 2 5' -CTATTTGGCCGTCATCAAGTG-3，(PAV R)第二对引物为为GPV正反向引物SEQ ID N0. 3 :5，-GGTCGCCCTTAGAAATG-3，(GPV F)SEQ ID N0. 4:5，-GCCTCGGTGATGAACTG-3，(CPV R)第三对引物为为GAV正反向引物SEQ ID NO. 5 5' -GTAGAAATAACCGCAGGAG-3，(GAV F)SEQ ID N0.6 :5，-GACTTGAGTATTCCACCTGA-3，(GAV R)具体的，本专利技术还提供了一种利用多重PCR反应同时检测小麦黄矮病种群中PAV、 GPV, GAV三种病毒的试剂盒，该试剂盒包含上述引物组，还包含进行多重PCR反应的试剂 浓度为0. 4X-0. 9 X的缓冲液；浓度为0. 1-0. 5mM的dNTPs ；浓度为1. 0-3. 5mM的Mg2+。优选地，上述试剂盒中缓冲液浓度为0. 4X、0. 5X、0. 6X、0. 7X、0. 8X或0. 9X ； dNTPs 浓度为 0. lmM、0. 2mM、0. 3mM、0. 4mM 或 0. 5mM ；Mg2+浓度为 1. OmMU. 5mM、2. OmM,2. 5mM, 3. OmM 或 3. 5mM ；优选地，上述试剂盒中还包含Taq DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶浓度为0. 04U/ μ L-0. 06U/μ L 具体的，上述试剂盒包含上述三对引物，还包含浓度为0.9Χ的缓冲液，浓度为 0. 4mM的dNTPs，浓度为3. 5mM的Mg2+，浓度为0. 06U/ μ L的Taq DNA聚合酶。优选地，该试剂盒中3对引物之间的比例为PAV GPV GAV = 2 1 1。应用上述引物对和试剂盒进行小麦黄矮病毒检测的方法包括小麦病毒总RNA的 提取、逆转录反应制备cDNA模板，多重PCR反应，电泳检测，确定病毒种类，其中多重PCR反 应的条件为退火温度为511、521、531、541或551；循环次数为20、25、30、35、40或45 次；延伸时间为30、35、40、45、50或55s。优选地，退火温度为51_55°C ；循环次数为20-45 次；延伸时间为30-55s。应用本专利技术的引物组和试剂盒进行多重PCR反应检测小麦黄矮病对田间复合侵 染的小麦材料检测具有快速、省时、节约成本等优势。附图说明图1是三种病毒单重PCR检测结果M =DNA分子量标准；1 健康小麦；2_4分别为 PAV, GPV, GAV感染的小麦图2是应用多重PCR对陕西各地区BYDVs种群的田间检测1 =DNA分子量标准；2 健康小麦；3-12 凤翔、眉县、长武、旬邑、彬县、杨凌、武功、周至、成阳、合阳和韩城感染黄 矮病的小麦。具体实施例方式为了理解本专利技术，下面以实施例进一步说明本专利技术，但不限制本专利技术。引物的设计和合成根据BYDV-PAV株系杨凌分离物、GPV株系中国分离物、GAV株系中国分离物的外壳 蛋白基因序列、DNAMAN软件计算引物Tm值，选择Tm值较一致的各条引物，保证在同一个退 火温度下同时检测到PAV、GPV和GAV 3种病毒。通过Primer Primier 5. 0和Blast序列 比对方法对引物进行互补性测试，选择互补性最低的引物对，优化多重PCR的引物，核苷酸 序列为SEQ ID NO. 1-6，由南京金思特公司合成。 单重PCR反应总RNA 提取小麦黄矮病株材采集自凤翔、眉县、长武、旬邑、彬县、杨凌、武功、周至、成阳、合阳 和韩城。分别称取PAV，GPV, GAV感染的小麦(分别标记为样品2、样品3、样品4)各0. Ig 于_80°C深冻研钵中，加液氮充分研磨，迅速转入到无RNase的无菌1. 5mL eppendof管中， 力口入 ImL BIOzol Extraction Reagent 混勾，放置 15min。力口入 0. 2mL 氣仿禾口 0. 3ml 苯酷溶 液上下倒置混勻，4°C 12000Xg离心15min。取上清液转入新印pendof管中，加入与上清 液等体积的异丙醇，振荡混勻，_20°C放置30min。4°C 12000Xg离心15min，弃上清液。用 ImL 75%乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀，4°C 12000 X g离心5min，弃上清液，自然干燥。加 入30 μ L DEPC水溶解沉淀。_80°C保存备用，获得3种病毒的总RNA，同时以健康烟草(标 记为样品1)总RNA为阴性对照，提取方法同上。RT 反应分别对每种病毒的总RNA进行逆转录反应。用M-MLV反转录酶反转录合成各病 毒cDNA第一链25yLRT反应体系如下2yL总RNA，lyL病毒引物(SEQ ID NO. 2、S本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用多重ＰＣＲ反应同时检测小麦黄矮病种群中ＰＡＶ、ＧＰＶ、ＧＡＶ三种病毒的引物组，该引物组由如下三对引物组成： 第一对引物为ＰＡＶ正反向引物 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１：５’－ＡＴＧＡＡＴＴＣＡＧＴＡＧＧＣＣＧＴＡＧＧ－３’ ＳＥＱＩＤ ＮＯ．２：５’－ＣＴＡＴＴＴＧＧＣＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＴＧ－３’ 第二对引物为：为ＧＰＶ正反向引物 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３：５’－ＧＧＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＡＡＡＴＧ－３’ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４：５’－ＧＣＣＴＣＧＧＴＧＡＴＧＡＡＣＴＧ－３’ 第三对引物为：为ＧＡＶ正反向引物 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５：５’－ＧＴＡＧＡＡＡＴＡＡＣＣＧＣＡＧＧＡＧ－３’ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６：５’－ＧＡＣＴＴＧＡＧＴＡＴＴＣＣＡＣＣＴＧＡ－３’。
【技术特征摘要】
一种利用多重PCR反应同时检测小麦黄矮病种群中PAV、GPV、GAV三种病毒的引物组，该引物组由如下三对引物组成第一对引物为PAV正反向引物SEQ ID NO.15’ ATGAATTCAGTAGGCCGTAGG 3’SEQ ID NO.25’ CTATTTGGCCGTCATCAAGTG 3’第二对引物为为GPV正反向引物SEQ ID NO.35’ GGTCGCCCTTAGAAATG 3’SEQ ID NO.45’ GCCTCGGTGATGAACTG 3’第三对引物为为GAV正反向引物SEQ ID NO.55’ GTAGAAATAACCGCAGGAG 3’SEQ ID NO.65’ GACTTGAGTATTCCACCTGA 3’。2.一种利用多重PCR反应同时检测小麦黄矮病种群中PAV、GPV、GAV三种病毒的试 剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的引物组，还包含进行多重PCR反应的试剂浓度为 0. 4 X-0. 9 X 的缓...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴云锋，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：61[中国|陕西]
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