禽流感病毒间接原位ＲＴ－ＰＣＲ检测方法技术

本发明专利技术公开了一种特异性好、敏感性高的禽流感病毒间接原位ＲＴ－ＰＣＲ检测方法，从ＧｅｎｅＢａｎｋ下载禽流感病毒ＮＰ基因序列，通过比对选取ＮＰ基因中较为保守的片段，设计一对引物，运用ＲＴ－ＰＣＲ法合成检测所用的标记探针，然后在经前处理后的细胞涂片和石蜡切片上用上述引物进行原位ＲＴ－ＰＣＲ，再与地高辛标记的探针进行原位杂交，对细胞和组织中的禽流感病毒进行检测和定位。研究结果表明，本方法能检测出约１ｐｇ／ｕＬ质粒的ＤＮＡ，并能特异性地在细胞涂片和石蜡组织切片中检测和定位禽流感病毒，且成纤维细胞感染病毒８ｈ后即可检测到阳性信号，具有良好的特异性和较高的敏感性，为动物组织中禽流感病毒的检测定位和致病机理研究提供了敏感、特异和更为直观的方法。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种禽流感病毒间接原位ＲＴ－ＰＣＲ检测方法，其特征在于，包括以下步骤：　　（１）根据ＧｅｎＢａｎｋ数据库中ＡＩＶ　ＮＰ基因的核苷酸序列，设计一对引物，核苷酸序列及长度如下表：　　引物名称　引物序列　扩增长度（ｂｐ）　　Ｐ１　５’－ＡＡＧＣＧＧＡＧＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＣ－３’　２７０　　Ｐ２　５’－ＡＴＧＴＣＡＡＡＧＧＡＡＧＧＣＡＣＧＡＴ－３’　　（２）利用上述的引物序列通过ＲＴ－ＰＣＲ法制备探针，采用地高辛标记；　　（３）样品的采集和标本的制备，将细胞或组织固定在玻片上，并作蛋白酶Ｋ消化预处理；　　（４）原位ＲＴ－ＰＣＲ反应，在处理好的组织或细胞片上，加入反应液进行反转录和两次原位ＰＣＲ扩增；...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨素，陈博文，沙才华，廖明，徐海聂，廖秀云，
申请(专利权)人：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：44[中国|广东]