本发明专利技术公开了一种检测样本中人乳头瘤病毒的方法，该方法依次包括如下步骤：Ａ）提取样本中的ＤＮＡ；Ｂ）将步骤Ａ）提取得到的ＤＮＡ进行扩增；Ｃ）ＰＣＲ扩增；以及Ｄ）病毒检测；其中，步骤Ｂ）中所述的扩增为：采用Ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚合酶对步骤Ａ）提取得到的ＤＮＡ进行全基因多重置换扩增。本发明专利技术还公开了Ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚合酶在检测人乳头瘤病毒中的应用。采用本发明专利技术的检测方法时，可以显著地提高ＨＰＶ的检出率；而且使用Ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚合酶进行ＭＤＡ扩增，样本无需纯化，对基因组扩增均匀，扩增产量稳定，操作简单，不依赖ＰＣＲ反应，无非特异性扩增产物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒^r测
，尤指一种一企测HPV的方法以及其它 Phi29DNA聚合酶在才企测病毒中的应用。
技术介绍
宫颈癌在全球妇女的癌症死因中高居第二位，世界上每年的新发病例 约为45万，死亡率为50%。 Drs.Rous and Beard最早在1934曾经提出 HPV为致癌物质，此后自1974年ZurHausen提出HPV是宫颈癌的最可 能因素后，国内外学者就HPV感染与子宫颈癌的关系进行了大量的研究， 并荻取了许多实5全室与临床证据。1977年Laverty在电镜中观察到子宫颈 癌活;险组织中存在HPV颗粒，1981年第一次在生殖道分离出了 HPV， 1983-1986年依次从宫颈癌样本中分离出HPV16、 18、 31、 35等型別。1995 年IARC专题讨论会确定HPV感染是子宫颈癌的主要病因。目前研究发 现99.7%的宫颈鳞状细胞癌有人乳头瘤病毒的感染，而高危型人乳头状瘤 病毒的持续感染是宫颈癌发病的重要因素。人乳头瘤病毒(Human Papillomaviruses, HPV)属乳多空病毒科A亚群 内的一组DNA病毒，外形呈20多面体对称型，无包膜，直径约45nm-55 nm,基因组为共价闭合环状双链DNA分子，含近8000个碱基对(bp)。 HPV基因组含8个开放读码框架；可分为三个基因区，包括两个编码区 和一个非编码调控区。编码区分为E区和L区，E区包4舌E1、 E2、 E4、 E5、 E6、 E7; L区包括L1、 L2,分别编码早期蛋白和晚期蛋白，六个E 蛋白主要负责病毒DNA的复制、转录和细胞转化，两个L蛋白为衣壳蛋 白主要负责病毒颗粒的组装和DNA包装。当分离林病毒Ll区序列与已知序列近源病毒抹同源性少于90%时， 就可被确定为 一种新的HPV型别，按照HPV亚型与癌症相关性的高低将 HPV分为高危型和低危型。高危型HPV包括HPV-16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 56、 58、 59、 68、 73和82;可能的高危型包括HPV26、 53和66;低危型包4舌HPV6、 11、 40、 42、 43、 44、 54、 61、 70、 72、81和CP6108。 HPV与多种疾病密切相关，低危型HPV能引起良性生殖 器疣；而高危型HPV则可引起宫颈癌、外生殖器癌及高度子宫颈上皮内 瘤等恶性病变。因此，HPV感染的检测和分型对了解女性生殖道肿瘤相 关病情、判断预后、指导治疗、分析HPV流行状况以及基因疫苗的研制 均具有重要价值。由于HPV具有高度种属特异性，难以在体外常规细胞培养系统中培 养，也不能通过分离病毒来确定型别，目前缺少一种可行的血清学技术检 验手段，因此，HPV的检测只能依赖对其DNA序列的分子水平的检查。第二代杂交捕获法(hybrid caputure II， HC-II)是经美国FDA认证 的可应用于临床的HPVDNA检测技术，HC-II采用孔平板法，可一次检 测13种高危型HPV病毒(包4舌16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 56、 58、 59、 69)型，具体操作步骤样本DNA双链被释放并分解为核苷 酸单链。DNA单链与RNA探针结合为RNA-DNA杂交体。特异性抗体将 RNA-DNA杂交体固定在微孔壁上。结合有碱性磷酸酶的多个二抗与RNA -DNA杂交体结合，放大信号。碱性磷酸酶使酶底物发光，根据光的强弱 确定碱性磷酸酶的含量，从而确定RNA-DNA杂交体的含量。检测结果的 判断标准是RLU(相对光单位，光信号)/ Cutoff(域值=三个阳性质控指标 的平均值)>1为阳性，<1为阴性。HC-II检测灵敏度高、重复性好且客观 性强，然而缺点是无法明确宫颈病变中感染的HPV型别。导流杂交技术(简称HybriMax)是一种结合低密度基因芯片与导流 杂交的新型检测技术，可进行21种HPV型别(6、 11、 16、 18、 31、 33、 35、 39、 42、 43、 44、 45、 51、 52、 53、 56、 58、 59、 66、 68、 CP8304) 的检测。导流杂交技术原理将探针固定于膜纤维中，使目标分子主动导 流穿过固定有探针的薄膜并与互补探针相结合，形成复合物而被固定下 来。未被结合固定的分子穿过薄膜后被除去。因此，它加速了互补分子之 间的相互作用，将杂交时间从几个小时降低至几分钟，比传统杂交法省时 几百倍。21种型别探针共同固定于一张膜条上，检测结果可以通过肉眼 或专用软件获得，阳性点为清晰可见的蓝紫色圆点，根据膜条HPV型别 分布图，判断阳性点为何种型别，结果直观易判。 一台机器一次可检测 15个标本，方便易行。膜条上另固定有杂交对照点Biotin和内对照点IC， 分别检测杂交过程和PCR反应过程。国外报道HybriMax检测诊断高级别 病变的灵敏度为92.7% ,有资料表明，HybriMax与HC-II对13种高危型4HPV的检测结果总符合率达90%以上。另有数据表明，对HybriMax检测 出的HPV16型标本中的E6/E7基因序列进行测序，发现检测的准确性达 100%。因此，HybriMax可被认为是较理想的HPV检测分型方法。 但是，上述HC-II法和HybriMax法均存在着漏检的可能性。 Phi29DNA聚合酶是从一种携带有噬菌体phi29 DNA聚合酶基因重 组E.coli菌抹(An五.co// strain that carries the phi29 DNA Polymerase gene from bacteriophage phi29 )中发现的，能够在30°C条件下对DNA进行扩 增的酶。这种酶是人们在扩增大的环状DNA模板如质粒或噬菌体DNA 时发现了这种酶具有滚环扩增DNA的能力，由Blanco等于1984年率先 报道(1984， Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 81, 5325-5329 )。最早该酶被用于 扩增环状DNA，称为滚环扩增方法。但是后来发现phi29DNA聚合酶还 可以扩增线性DNA (称为多重置换扩增_ multiple displacement amplification, MDA )。在MDA中，phi29 DNA聚合酶和耐核酸外切酶 活性的随机引物，不需要经过PCR热循环过程，只在3(TC条件下恒温即 可反应。将上述反应中的模板换成人类基因组DNA,发现线性的模板同 样也可被扩增，其扩增的机制是一种链置换反应。首先随机6碱基寡核苷 酸作为引物在多个位点与基因组模板DNA退火，接下来phi 29 DNA聚合 酶在DNA的多个位点同时起始复制，它沿着DNA模板合成DNA,同时 取代模板的互补链。被置换的互补链又成为新的模板来进行扩增，成为一 个级联分支的放大系统。因此最终可以获得大量高相对分子质量的DNA， 因而，这种方法4皮称为多重置换扩增(multiple displacement amplification, MDA)。由于phi29DNA聚合酶对于模板有很强的模板结合能力，能连续扩 增100kb的DNA模板而不从模板上解离，平均片段长度大于10本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测样本中人乳头瘤病毒的方法，该方法依次包括如下步骤： Ａ）提取样本中的ＤＮＡ； Ｂ）将步骤Ａ）提取得到的ＤＮＡ进行扩增； Ｃ）ＰＣＲ扩增；以及 Ｄ）病毒检测； 其特征在于：步骤Ｂ）中所述的扩增为：采用Ｐｈ ｉ２９ＤＮＡ聚合酶对步骤Ａ）提取得到的ＤＮＡ进行全基因多重置换扩增。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张艳，管爱民，顾关林，马式薇，何昕，李宁丽，黄立东，姜惠明，王利，沈佰华，蔡佩明，陈勇，
申请(专利权)人：上海市免疫学研究所，上海多纳美企业发展有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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