乙肝耐药突变测序试剂盒及测序方法技术

一种乙肝耐药突变测序试剂盒及测序方法，所述的试剂盒包括：１）特异性扩增乙肝病毒基因的引物，其碱基序列如ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：１？ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：２？ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：３和ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：４所示；２）乙肝病毒特异性测序引物，其碱基序列如ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：５？ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：６ＳＥＱ？ＩＤＮＯ：７ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：８ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：９和ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ：１０所示；上述所有序列可由其碱基互补序列替换；所述的测序方法，包括：１）ＨＢＶ？ＤＮＡ模板抽提；２）以步骤１）所得ＤＮＡ为模板，利用所述特异性扩增乙肝病毒基因的引物进行ＰＣＲ扩增；３）上述ＰＣＲ产物以所述的标记生物素进行单链纯化；４）以步骤３）所得单链纯化产物进行测序；５）结果分析；本发明专利技术能同时检测拉米夫定、恩替卡韦、阿德福韦和替诺福韦耐药突变以及病毒突变株的比例，为临床诊疗提供了更全面的参考信息。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是一种乙肝耐药突变测序试剂盒及乙肝耐药突变的测序方法，属于病毒耐药突变检测领域
技术介绍
乙型肝炎病毒(HBV)是导致肝脏疾病的主要致病因子，全球已有近4亿人成为慢性HBV携带者，其中75％的感染发生在亚洲并作为慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要原因。我国是最主要的乙肝大国，2002年我国流行病学调查显示，乙肝表面抗原阳性率9.09％，约1.2亿，慢性乙型病毒性肝炎病人约3000万。目前这类人群正处在发病和治疗的高峰时期。目前公认有效的抗HBV药物主要包括核苷(酸)类似物和α干扰素。研究表明干扰素的疗效与基础核心启动子(BCP)区A1762+G1764位点的双变异密切相关。核苷(酸)类似物因具有服用方便、不良反应小、适应症广泛等特点而被广泛应用，但长期服用核苷(酸)类似物，有可能产生耐药性突变，从而导致病情反弹。在长期抗病毒治疗中，HBV出现聚合酶(P)区基因区耐药变异已经成为目前临床医师进行CHB治疗面临的主要问题。为便于临床医师在抗HBV治疗过程中监测耐药变异情况，适时选择药物及改变治疗方案，需要有方便、快速、准确的检测HBV相关耐药位点的变异发生情况的方法。 目前临床常见的HBV耐药位点的检测试剂盒大多为单一检测YMDD区的荧光定量PCR试剂，这类试剂无法同时检测多个耐药位点的突变；也可以先PCR再进行Sanger测序，可以进行HBV耐药位点突变的检测，最近几年不断改进的测序系统(如ABI公司377等)能满足较大通量的检测HBV耐药突变，但该方法并不能得出各突变位点发生变异的具体频率的精确数据，这将会影响临床医师CHB治疗方案的制定和改进；而基因芯片检测HBV耐药位点的突变也不能得到耐药突变的准确频率，另外该方法成本太高，不适宜进行临床推广。 焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是新一代DNA序列分析技术，是一种基于DNA合成过程中伴随着焦磷酸(PPi)的释放并进行检测的技术。在酶联反应中，掺入的核苷酸的数量比能等比的显示为不同强度的荧光信号。该技术具有快速、准确、经济、实时检测的特点，不需要凝胶电泳，也不需要对DNA样品进行任何特殊形式的标记和染色，有很高的可重复性、高度的并行性和高度的自动化，特别适用于已知基因的突变分析。特别是耐药突变的准确频率对指导患者选择抗病毒药物、是否继续使用该抗病毒药物、何时停用或换用何种抗病毒药物都有很现实的临床意义，对病人抗病毒治疗的疗效判断、预后评估十分重要。迄今为止国内外未见应用焦磷酸测序技术同时检测乙肝病毒多耐药位点和准确突变频率的产品和报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种。 为达上述目的，本专利技术采用如下技术方案 一种乙肝耐药突变测序试剂盒，该试剂盒包括 (1)特异性扩增乙肝病毒基因的引物，其碱基序列如SEQ ID NO1 SEQ ID NO2SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示； (2)乙肝病毒特异性测序引物，其碱基序列如SEQ ID NO5 SEQ ID NO6SEQ IDNO7SEQ ID NO8SEQ ID NO9和SEQ ID NO10所示； 上述所有序列可由其碱基互补序列替换。 所述SEQ ID NO4标记生物素。 一种利用如上所述的乙肝耐药突变测序试剂盒检测乙肝耐药突变的测序方法，该方法包括如下步骤 1)HBV DNA模板抽提； 2)以步骤1)所得DNA为模板，利用所述特异性扩增乙肝病毒基因的引物进行PCR扩增； 3)上述PCR产物以所述的标记生物素进行单链纯化； 4)以步骤3)所得单链纯化产物进行测序； 5)结果分析。 一、HBV DNA模板抽提，包括(1)、待测标本及阴性体检对照血清融化后，在0.5ml离心管中，取100μl血清，加入100μl浓缩液，剧烈振荡15s，13000rpm离心10min； (2)、吸去上清(尽量吸干净)，往沉淀中加入30μl裂解液，剧烈振荡15s； (3)、4000rpm甩一下使裂解液处于管底，金属浴101℃12min，完成后-20℃冷却1-2min，此时不能开盖，防止气溶胶污染，13000rpm离心10min，上清作为PCR模板用于检测。 二、所述的PCR扩增采用巢式PCR，即第一次用SEQ ID NO1SEQ ID NO2引物对进行扩增；第二次以第一次PCR产物为模版用SEQ ID NO3和SEQ ID NO4引物对进行扩增，每一标本扩增平行的6管。PCR体系及条件如下 三、焦磷酸测序 四、结果分析 附图说明 图1是本专利技术的乙肝病毒耐药突变测序结果图。 图2是本专利技术的另一乙肝病毒耐药突变测序结果图。 图3是本专利技术的又一乙肝病毒耐药突变测序结果图。 图4是本专利技术的又一乙肝病毒耐药突变测序结果图。 图5是本专利技术的又一乙肝病毒耐药突变测序结果图。 图6是本专利技术的又一乙肝病毒耐药突变测序结果图。 具体实施例方式 附图标号说明 编 氨基酸 氨基酸 氨基酸中文名 碱基位点 野生型 突变型 号 位点 简称 1 169I-T 异亮氨酸-苏氨 634-636 ATTB、C、D、EACA、ACT 酸 ATAA、F、G、H 2 173V-L 缬氨酸-亮氨酸 646-648 GTGTTG、CTG 3 180L-M 亮氨酸-甲硫氨 667-669 CTGC、D、E、FATG 酸 TTGA、B、G、H 4 181A-V/T 丙氨酸-苏氨酸 670-672 GCTACT、GGT /缬氨酸 5 184T-G/S/A 苏氨酸-甘氨酸 679-681 ACTGGT、CTT、 /C/L/丝氨酸/丙氨酸 TCT、AGT、/半胱氨酸/亮氨 GCTTGT酸 6 194A-T丙氨酸-苏氨酸 709-711GCTACT 7 202S-I/G 丝氨酸-异亮氨 733-735AGCA、G ATT、ATC、酸/甘氨酸GGT、GGC AGTB、C、D、E、F、H 8 204M-I/V 甲硫氨酸-异亮 739-741ATGATT、ATC、氨酸/缬氨酸 ATA、GTG、 GTC、GTA 9 236N-T天冬酰胺-苏氨 835-837AACA、B、C、D、G、H ACC、ACT酸 AATE、F 10 250 M-V甲硫氨酸-缬氨 877-879ATGGTG酸 一、HBV DNA模板抽提，包括(1)、待测标本及阴性体检对照血清融化后，在0.5ml离心管中，取100μl血清，加入100μl浓缩液，剧烈振荡15s，13000rpm离心10min； (2)、吸去上清(尽量吸干净)，往沉淀中加入30μl裂解液，剧烈振荡15s； (3)、4000rpm甩一下使裂解液处于管底，金属浴101℃12min，完成后-20℃冷却1-2min，此时不能开盖，防止气溶胶污染，13000rpm离心10min，上清作为PCR模板用于检测。 二、所述的PCR扩增采用巢式PCR，即第一次用SEQ ID NO1SEQ ID NO2引物对进行扩增；第二次以第一次PCR产物为模版用SEQ ID 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乙肝耐药突变测序试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：　　１）特异性扩增乙肝病毒基因的引物，其碱基序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２　ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：３和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４所示；　　２）乙肝病毒特异性测序引物，其碱基序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０所示；　　上述所有序列可由其碱基互补序列替换。

【技术特征摘要】
1.一种乙肝耐药突变测序试剂盒，其特征在于该试剂盒包括1)特异性扩增乙肝病毒基因的引物，其碱基序列如SEQ ID NO1 SEQ ID NO2 SEQID NO3和SEQ ID NO4所示；2)乙肝病毒特异性测序引物，其碱基序列如SEQ ID NO5 SEQ ID NO6 SEQ ID NO7 SEQ ID NO8 SEQ ID NO9和SEQ ID NO10所示；上述所有序列可由其碱基互补序列替换。2.根据权利要求1所述的乙肝耐药突变测序试剂盒，其特征在于所述SEQ ID NO4标记生物素。3.一种利用如权利要求1或2所述的乙肝耐药突变测序试剂盒检测乙肝耐药突变的测序方法，该方法包括如下步骤1)HBV DNA模板抽提；2)以步骤1)所得DNA为模板，利用所述特异性扩增乙肝病毒基因的引物进行PCR扩增；3)上述PCR产物以所述的标记生物素进行单链纯化；4)以步骤3)所得单链纯化产物进行测序；5)结果分析。4.根据权利要求3所述的利用乙肝耐药突变测...

【专利技术属性】
技术研发人员：任绪义，
申请(专利权)人：温州迪安医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：33[中国|浙江]