蜜柑萎缩病毒ＲＴ－ＰＣＲ检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测温州蜜柑萎缩病毒的ＲＴ－ＰＣＲ检测方法和试剂盒，属于生物技术领域。本方法通过提取核酸、应用温州蜜柑萎缩病毒特异性引物进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增及电泳来判断检测样品中是否存在温州蜜柑萎缩病毒：电泳图谱中如出现２５１ｂｐ特征性条带，表明该样品中存在温州蜜柑萎缩病毒，如果没有出现２５１ｂｐ特征性条带，表明该样品中不存在温州蜜柑萎缩病毒。本发明专利技术还相应地建立了检测试剂盒，可特异、灵敏、高效地检测温州蜜柑萎缩病毒，适用于田间样品检测、温州蜜柑萎缩病毒流行监控、脱毒苗木鉴定等多种用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于一种PT-PCR检测方法及其检测用试剂盒，具体的说，涉及一种温州蜜 柑萎缩病毒的RT-PCR检测方法及试剂盒
技术介绍
温州蜜柑萎缩病是日本温州蜜柑生产上的重要病害，自从1937年发现以来已经 遍及各个柑橘产区。20世纪80年代以来，我国研修人员从日本携带温州蜜柑优良品种回国 时无意中将该病带入浙江黄岩、重庆奉节和江苏吴县。该病可通过嫁接、汁液和土壤传播， 并通过苗木运输进行远距离传播，可以危害几乎所有的柑橘属及近缘属的植物。但温州蜜 柑表现症状明显、受害严重。目前的防治方法主要是检测无病毒母树、推广无病毒苗木，并 挖除病树。该病由温州蜜柑萎缩病毒(Satsurm dwarf virus, SDV)引起。SDV为双分体病 毒，包含两条正单链RNA分子RNAl和RNA2，是豇豆花叶病毒科，线虫传多面体病毒属 的暂定成员。由于多数寄主植物受侵染后不表现明显症状，病原检测显得更为重要。传统 的检测方法是指示植物鉴定，主要用白芝麻，可以检测到春梢嫩叶中的病毒。但是，白芝麻 检测季节性强、周期长、症状易混淆，而且在检测过程中需要有温室做配套设施。血清学检 测SDV，受季节和寄主本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蜜柑萎缩病毒的ＲＴ－ＰＣＲ检测方法，其特征在于：以温州蜜柑萎缩病毒特异性上游引物、温州蜜柑萎缩病毒特异性下游引物对待测样品进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增，最后电泳鉴定；所述温州蜜柑萎缩病毒特异性引物为：　　上游引物：５’－ＧＧＧＡＧＡＴＧＡＴＡＧＧＡＧＣＡ－３’　　下游引物：５’－ＡＧＡＧＡＧＡＴＴＴＣＴＡＣＴＣＧＣＡ－３’。

【技术特征摘要】
一种蜜柑萎缩病毒的RT PCR检测方法，其特征在于以温州蜜柑萎缩病毒特异性上游引物、温州蜜柑萎缩病毒特异性下游引物对待测样品进行RT PCR扩增，最后电泳鉴定；所述温州蜜柑萎缩病毒特异性引物为上游引物5’ GGGAGATGATAGGAGCA 3’下游引物5’ AGAGAGATTTCTACTCGCA 3’。2.根据权利要求1所述蜜柑萎缩病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤(1)核酸提取，取适量SDV寄主植物的叶或皮在液氮中充分研磨，加入核酸提取液提取 样品总核酸或RNA ；(2)逆转录反应，所用引物为SDV下游引物5’-AGAGAGATTTCTACTCGCA-3’，反应体系 5ul，包括核酸抽提液 1. 0μ L，10 X bufferO. 5 μ L, 25mmol/L 的 MgCl2 0. 5 μ L, 10mmol/L 的 dNTPO. 5 μ L, 10 μ mo 1/LSDV 下游引物 0. 5 μ L, 40U/ μ LRNAsinO. 1 μ L, 200U/ μ L 逆转录酶 0. 2 μ L，超纯水 1· 7 μ L，42°C温育 30min ；(3)扩增反应，所用上、下游引物分别为5’-GGGAGATGATAGGAGCA-3’、 5，-AGAGAGATTTCTACTCGCA-3，；反应总体积为25 μ L包括逆转录反应混合液5 μ L、 10Xbuffer2 μ L, 25mmol/L 的 MgCl2 L 5 μ L，10 μ mol/L 的 SDV 上游引物 0. 5 μ L, Taq DNA 聚合酶 0. 4yL，超纯水 15. 6yL;反应条件 94°C 4min，94°C 15s，63°C 15s，72°C 20s，5 个 循环；62°C，5个循环；61 °C，5个循环；60°C，10个循环；59°C，10个循环；72°C IOmin ；(4)琼脂糖凝胶或聚丙烯酰氨凝胶电泳、染色、获取电泳图谱；(5)依据上述图谱的条带特征诊断SDV的分子变异类型。3.根据权利要求2所述蜜柑萎缩病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于所...

【专利技术属性】
技术研发人员：周常勇，高艳玲，王雪峰，宋震，杨方云，周彦，李中安，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]