抗CD20四价抗体、其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了抗ＣＤ２０四价抗体、其制备方法和应用，更具体地，本发明专利技术公开了抗ＣＤ２０四价抗体Ｃ２Ｂ８（ＳｃＦｖＨＬ）↓［４］－Ｆｃ，其氨基酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：１８所示和２Ｆ２（ＳｃＦｖＨＬ）↓［４］－Ｆｃ，其氨基酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２０所示，以及其制备方法和其在制备抗Ｂ细胞淋巴瘤的药物中的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗体领域，更具体地，本专利技术公开了一种抗四价抗体、其制备 方法和其在制备抗B细胞淋巴瘤药物方法的用途。
技术介绍
恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所致死亡中高 居第二位。非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin， s ly即homa ， NHL)是临床最常见 的淋巴系统恶性肿瘤，其中B细胞来源的约占85。/。，好发于青壮年，发病率和病 死率呈逐年上升趋势。根据病情特点，NHL可分为低、中、高三度。其中低度 和部分中度NHL病程进展缓慢，统称为惰性NHL。它们对首次化疗敏感，但很容 易复发或耐药，当再次化疗或放疗时，疗效明显降低，因而被认为是难以治愈 的恶性肿瘤。近年来，单克隆抗体及其导向治疗NHL的临床试验研究取得了重 大进展，其中被广泛使用且富有成效的是抗CD20的单抗制剂。CD20抗原是一 种B细胞分化抗原，仅位于前B细胞和成熟B细胞，它在95 y。以上的B细胞性 淋巴瘤中表达，且表面密度很高，而在造血干细胞、血浆细胞和其他正常组织 中不表达。更为重要的是，CD20分子在与单克隆抗体结合后，无显著内化及脱 落，故成为治疗B细胞淋巴瘤的理想耙点。目前采用抗CD20抗体治疗非霍奇金淋巴瘤已取得了较好的疗效。 Rituxan(Rituximab， C2B8)为美国基因科技公司研制的以CD20为耙点的单克隆抗体，它是一种人鼠嵌合基因工程抗体，包含了鼠单克隆抗体的可变区基因和 入抗体的恒定区基因。 Rituxan己于1997年11月获FDA的批准上市，用于复 发性或顽固性低度或滤泡性非霍奇金淋巴瘤的临床治疗。尽管C2B8抗体在临床治疗中已显示出较好的疗效，仍有52% 的病人对C2B8治疗不产生反应。因此，寻求更为有效用于治疗B淋巴瘤的CD20 抗体药物显得尤为迫切。已有许多相关的研究阐述了抗CD20单克隆抗体可能的作用机制，主要包括 扑体介导的细胞溶解作用(CDC作用)，抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC) 和对肿瘤细胞的诱导凋亡作用(Apoptosis)及生长抑制作用。而对于抗CD20 抗体主要通过其中何种机制发挥抗肿瘤作用仍存在争论中。'可是，目前变得越 来越清楚的是，这些机制不是互相孤立地、而是互相协同地发生作用。因此 我们推测，对于C2B8抗体治疗不敏感的病人或许会对其它类型和结构的、发挥 不同生物学功能的抗CD20抗体产生反应。抗CD20抗体根据其体外生物学功能的不同可以分为两型I型CD20抗体包括C2B8和其它大部分CD20抗体，主要 通过CDC功能发挥作用而凋亡作用很弱；而II型CD20抗体包括B1和11B8，主 要通过凋亡发挥作用而CDC功能很弱。除了 I型抗体C2B8获批准用于临床治疗 以外，II型抗体Bl与mI偶联制备的标记抗体药物Tositumomab也已获得批准 用于非霍奇金氏淋巴瘤的治疗。更为重要的是，临床前试验已经表明11B8的裸 抗体同':"I标记的11B8抗体同样有效。因此，由于这两型抗体具有 明显不同的生物学活性，对于I型抗体治疗不敏感的病人很可能将会对II型的 治疗产生反应，而反之亦然。由此，我们想到，如果一种抗体既有很强的CDC 作用又具备很强的诱导凋亡的能力，它或许可以更为有效的杀伤CD20+肿瘤细胞。 经二抗交联后的CD20抗体具有明显增强的诱CD20+细胞凋亡的作用，因为这种方法用于体内治 疗则不可行，因而人们继续致力于制备新型有效的抗体分子。研究表明，成为 二聚体形式的抗体，其凋亡作用和生长抑制作用均可明显增强。 但是，通过化学交联法产生二聚体的方式存在很多缺陷，主要是二聚体抗体的 分子量大(300kDa)和半衰期短。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术的申请人进行了大量的实验，采用基因工程技 术构建了两种I型抗体C2B8和2F2的四价基因工程抗体，2F2是一种全人源抗 CD20单克隆抗体，其CDC作用强于C2B8抗体。本专利技术公开的四价抗CD20抗体 和原亲本抗体都可以与Raji细胞特异性结合，而且其相对亲和力相似，但本发 明公开的四价抗CD20抗体有更强的凋亡诱导作用和生长抑制功能，并具有能显 著提高荷瘤小鼠的生存率的优点。实验结果表明，本专利技术公开的四价抗体虽然具有四个抗原结合位点，构建 的四价抗体的分子量只比亲本两价抗体大25KDa，其在小鼠体内的血浆半衰期 稍长于亲本二价抗体，表明这种四价抗体的结构高度稳定；本专利技术的申请人进 而通过体内外试验比较四价抗体和原亲本二价抗体的抗肿瘤活性，研究结果表明，2F2的四价抗体 2F2(ScFvHL)广Fc不仅具有与其亲本两价抗体2F2相同的CDC和ADCC活性，而 且在促肿瘤细胞凋亡和生长抑制功能上较原二价抗体均有明显增强，甚至强于C2B8的四价抗体C2B8(ScFvHL)rFc。体内免疫治疗实验更进一步证 体2F2(ScFvHL)厂Fc在延长荷瘤SCID小鼠的生存期上明显强于其它 可以成为B淋巴瘤的治疗提供新型抗体药物。利用基因工程技术构建了四价抗CD20抗体，本专利技术公开了1， 一种抗CD20四价抗体；2， 上述1所述的抗CD20四价抗体为C2B8(ScFvHL)厂Fc; 3， 上述2的抗CD20四价抗体，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 18; 4， 编码上述3所述抗体的核苷酸序列，为SEQ ID N0:17; 5， 上述1所述的抗CD20四价抗体为2F2(ScFvHL)厂Fc; 6， 上述5所述的抗CD20四价抗体，其氨基酸序列为SEQ ID N0:20; ./， 编码上述6所述抗体的核苷酸序列，为SEQ ID N0:19 8， 制备上述的抗CD20四价抗体的方法，包括a. 构建CD20单抗c2B8或2F2的单链抗体ScFv并克隆获得人抗体 IgGlFc基因；b. 将2个相同的单链抗体基因串联连接后再与人抗体Fc段基因相连 得到融合基因；c. 将上述融合基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)，构建成真核表 达载体pcDNA3.1 (C2B8(ScFvHL)2Fc)或pcDNA3.1 (2F2(ScFvHL)2Fc);d. 表达载体 pcDNA3.1 (C2B8(ScFvHL)2Fc) 或 pcDNA3.1 (2F2(ScFvHL)2Fc)转染CHO细胞，筛选，进行亚克隆，将筛选得到 的高表达克隆用扩大培养，分离纯化即得。9. 一种制剂，含有上述l、 2、 3、 5、 6任一所述的抗体和可药用的载体。实，四价抗 三种抗体，10. 上述l、 2、 3、 5、 6、 9任一所述的抗体或制剂在制备抗B细胞淋巴瘤 的药物中的用途。11. 上述10的用途，其中B细胞淋巴瘤为非霍奇金淋巴瘤。12. 上述11的用途，其中非霍奇金淋巴瘤为低度和部分中度非霍奇金淋巴瘤。13. 上述10的用途，其中B细胞淋巴瘤为慢性淋巴性白血病。 更具体地，本专利技术的申请人通过大量实验，首先分别构建了 CD20单抗C2B8及2F2的单链抗体ScFvHL及ScFvHL，并克隆获得了人抗体IgGl， k的重链恒定 区基因。在此基础上采用分子克隆技术分别将单链抗体基因与人抗体Fc段基因 相连，进一步将上述融合基因克隆到真核表达载体pcDNA3. 1(+)，分别构建成真 核表达载体pcDNA3. 1 (C本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗ＣＤ２０四价抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郭亚军，李博华，张大鹏，钱卫珠，侯盛，王皓，
申请(专利权)人：上海中信国健药业有限公司，上海国健生物技术研究院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]