可溶性VEGFR双功能融合受体、其制备方法及用途技术

本发明专利技术公开了一种可溶性ＶＥＧＦＲ双功能融合受体、其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。更具体地，本发明专利技术公开了可溶性ＶＥＧＦＲ双功能融合受体ＶＥＧＦＲＦｃ、ＶＥＧＦＲＩｇ和ＶＥＧＦＲＩｇ的突变体ＶＥＧＦＲＩｇ及这些双功能融合受体的制备方法，这些双功能融合受体即能与ＶＥＧＦ和ＶＥＧＦ－Ｂ结合，还能与ＶＥＧＦ－Ｃ或ＶＥＧＦ－Ｄ相结合，可用于制备抗肿瘤药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，更具体地，本专利技术公开了一类双功能融合受体、 其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所 致死亡中高居第二位。而且近年来，其发病率呈明显上升趋势。恶性肿瘤治疗 效果差，晚期转移率高，预后多不佳。目前临床上所采用的常规治疗方法如放、 化疗和手术治疗虽然在很大程度上缓解了病痛，延长了生存时间，但这些方法 均存在很大的局限性，其疗效难以进一步提高。肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长期转为有血管 的快速增殖期，血管的生成使肿瘤能获得足够的营养而完成血管切换期，如果 没有血管的生成，原发肿瘤的生长不超过l 2mm，转移则无法实现。血管内皮 生长因子(VEGF)是一类能促进内皮细胞分裂增殖、促进新生血管的形成、提高 血管通透性的生长因子，它与细胞表面的血管内皮生长因子受体结合，通过激 活酪氨酸激酶信号转导途径发挥功能。在肿瘤组织中，肿瘤细胞、肿瘤侵入的巨 噬细胞和肥大细胞能分泌高水平的VEGF，以旁分泌的形式刺激肿瘤血管内皮细 胞，促进内皮细胞增殖、迁移，诱导血管形成，促进肿瘤持续生长,并提高血管通 透性，引起周围组织纤维蛋白沉着，促进单核细胞、成纤维细胞内皮细胞侵润，有 利于肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管,促进肿瘤转移，因而抑制肿瘤血管 生成被认为是当前最具有前途的肿瘤治疗方法之一。Genentech公司的抗癌 新药Avastin (抗VEGF人源化抗体)已于20Q4年2月获得美国FDA批准上市，用于一线治疗转移性结直肠癌，并有望用于其它肿瘤，包括非小细胞肺癌和肾癌的治疗。此外，用可溶性受体阻断VEGF和VEGFR的传导途径也被证明是一种行之有 效的方法。VEGF家族包括VEGF、 VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D、 VEGF-E及PIGF(胎盘 生长因子)，它们之间的氨基酸序列高度同源，都与同型的酪氨酸激酶受体结合。 血管内皮生长因子受体(VEGFR)属于酪氨酸激酶受体超家族，它们有相似的结 构，均由胞外区、跨膜区、胞内区组成。目前发现的VEGFR主要有3种 VEGFRl(Flt-1) ， VEGFR2(KDR)， VEGFR3。与VEGFR1结合的主要是VEGF、 VEGF-B， 与VEGFR2结合的主要是VEGF、 VEGF-C、 VEGF-D、 VEGF-E，与VEGFR3结合的主要 是VEGF-C、 VEGF-D。 VEGFR1和VEGFR2主要位于肿瘤血管内皮细胞表面，VEGFR1 主要介导细胞骨架重排及引起细胞迁移，VEGF对内皮细胞的增殖、分化由VEGFR2 介导。VEGFR3特异表达在淋巴内皮细胞中，在动脉、静脉、毛细血管内皮中基 本没有表达。VEGF-C和VEGF-D可通过VEGF-C/VEGF-D/VEGFR3信号系统发挥作 用，从而导致肿瘤淋巴管的增生和淋巴结的转移。 Regeneron制药公司将VEGFRl膜外区与抗体Fc进行融合，制备了 VEGFR-Fc融合蛋白，它能与血管内皮细胞表面的VEGFR竞争性结合VEGF和 VEGF-B，从而抑制VEGF和VEGF-B的生物活性，阻断新生血管的形成，实验结果 表明VEGFR1-Fc具有比Avastin更强的抗肿瘤作用。但是，无论是Avastin还是VEGFR1-Fc都是通过阻断VEGF或/和 VEGF-B所诱导的生物学功能，即抑制肿瘤的血管生成来发挥抗肿瘤作用。它们 均不能与VEGF-C或VEGF-D相结合，而VEGF-C和VEGF-D可诱导肿瘤内淋巴管生成， 进而促进肿瘤淋巴结转移，所以它们不能抑制肿瘤淋巴结转移。因此，研究出既能与血管内皮细胞表面的VEGFR竞争性结合VEGF和VEGF-B， 还能与VEGF-C或VEGF-D相结合，从而不仅抑制VEGF和VEGF-B的生物活性，阻断 新生血管的形成，还能阻断VEGF-C和VEGF-D对肿瘤内淋巴管生成的诱导，防止 肿瘤淋巴结转移的高效抗肿瘤药物一直是本领域的技术人员急待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术公开了1. 一种可溶性双功能VEGFR融合受体，为包含VEGFR1和VEGFR3在内的融合蛋 白，既能与VEGF和VEGF-B结合，还能与VEGF-C或VEGF-D相结合。2. 上述1所述的可溶性双功能VEGFR融合受体，为VEGFRIg，其轻链的氨基酸序 列为SEQ ID N0:8所示，重链的氨基酸序列为SEQ ID N0:10所示的。3. 上述2所述的可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFRIg的突变体，为VEGFRIgM， 其轻链的氨基酸序列为SEQ ID N0:14所示，重链的氨基酸序列为SEQ ID NO: 10 所示。4. 上述1所述的可溶性双功能VEGFR融合受体，为VEGFRFc，其特征在于有两 个相同的多肽链通过二硫键结合，其中多肽链的氨基酸序列为SEQ ID N0:12所 示。5. —种分离的核酸分子，编码上述1-4任一所述的可溶性双功能VEGFR融合受 体。6. —种分离的核酸分子，编码上述2所述的可溶性双功能VEGFR融合受体 VEGFRIg，其中编码轻链的核苷酸序列为SEQ ID N0:7，编码重链的核苷酸序列 为SEQ ID NO:9。7. —种分离的核酸分子，编码上述3所述的可溶性双功能VEGFR融合受体 VEGFRIg的突变体VEGFRIgM,其中编码轻链的核苷酸序列为SEQ ID N0:13,编 码重链的核苷酸序列为SEQ ID N0:9。8. —种分离的核酸分子，编码上述4所述的可溶性双功能VEGFR融合受体 VEGFRFc中的多肽链，具有SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列。9. 一种载体，含有上述5、 6、 7、 8任一所述的核酸分子和所述核酸分子的序列 操作性相连的表达调控序列，其中载体可以为pDRl， pcDNA3. 1 ( + )， pc薩3. 1/ZE0(+) ， pDHFR之一。10. 上述9所述的载体，为pcDNA3. 1 ( + )或pcDNA3. 1/ZE0(+)。11. 一种宿主细胞，含有上述9所述的载体，为真核细胞。12. 上述ll所述的宿主细胞，为哺乳动物细胞。13. 上述12所述的宿主细胞，为CH0细胞。14. 一种制备上述1-4任一所述的可溶性双功能VEGFR融合受体的方法，该方法 包括a) 在表达条件下，培养上述11-13任一所述的宿主细胞，表达双功能融合 受体，b) 分离或纯化所述的双功能融合受体。15. —种组合物，含有上述1-4任一所述的可溶性双功能VEGFR融合受体和药学 上可接受的载体。16. 上述1-4任一所述的可溶性双功能VEGFR融合受体在制备抗肿瘤药物中的 用途。17. 上述15所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。18. 上述16、 17任一所述的用途，还包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。任何编码VEGFR1和VEGFR3的合适的DNA都适合于本专利技术，这样的结构包 括从RT — PCR激活的淋巴细胞mRNA中分离得到的VEGFR1，从根据 embl|AR860556|AR860556中序列全基因合成的VEGFR 3 ，或从其他cDNA文库中 获得的。本专利技术中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可溶性双功能ＶＥＧＦＲ融合受体，为包含ＶＥＧＦＲ１和ＶＥＧＦＲ３在内的融合蛋白，既能与ＶＥＧＦ和ＶＥＧＦ－Ｂ结合，还能与ＶＥＧＦ－Ｃ或ＶＥＧＦ－Ｄ相结合。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郭亚军，王皓，李博华，张大鹏，寇庚，侯盛，钱卫珠，
申请(专利权)人：上海中信国健药业有限公司，上海国健生物技术研究院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]