一种黑色素瘤相关抗原的单克隆抗体及其用途和药物组合物制造技术

本发明专利技术公开了一种新发现的能够识别黑色素瘤的特异性抗原的单克隆抗体，本发明专利技术还公开了该单克隆抗体在黑色素瘤细胞的分离、黑色素瘤的检测中的作用，本发明专利技术还涉及包含该单克隆抗体的药物组合物，其对于黑色素瘤的免疫治疗也是非常有用的，本发明专利技术还涉及该单克隆抗体的重组蛋白。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫学领域，具体地说，本专利技术涉及黑色素瘤相关抗原、黑色素瘤相关抗原的单克隆抗体及其用途。
技术介绍
恶性黑色素瘤是一种恶性程度很高的肿瘤，发生在头颈者约占全身的20％，主要发生于皮肤与腔、窦粘膜。人恶性黑色素瘤通常始于有害的黑痣，这些黑痣在辐射刺激后生长，形成破坏性的转移黑色素瘤。黑色素瘤极易向全身扩散，在临床上难以控制。化学治疗和放射性治疗通常对黑色素瘤不起作用。 目前，黑色素瘤免疫组织化学检测通常使用的抗体是HMB-45、抗S-100和NKI/C3(参见Smoller BR，PATHOLOGYState of the Art Reviews，2371-383，1994)。 HMB-45是一种已知的抗人黑色素细胞的单克隆抗体，它能识别前黑色素小体球蛋白，能够与黑色素瘤相关抗原gp-100反应。HMB-45还能作用于黑色素瘤、连接痣、纺锤状细胞和上皮细胞痣、先天痣等。然而，由于HMB-45缺乏高度的敏感性(其敏感性介于67％-93％之间)，在进行检测时会遗留一定量的黑色素瘤不易被检测出(参见Wick MR et al.，J Cutan Pathol 1988；15201-207；Ordonez NG et al.，Am.J.Clin.Pathol.1988；90385-390)。 S-100蛋白的抗体比HMB-45具有更高的敏感性(参见Nakajima T et al.，Cancer 1982；50912-918；Kindblom LG et al.，Acta.Pathol.Macrobial.Immunol.Scand.1984；92219-230)，但是它的特异性很差。抗S-100抗体可能附着到良性细胞上，如唾液腺和汗腺、骨骼肌和心肌、组织细胞、Schwann细胞、脂肪细胞、软骨细胞、星形胶质细胞、少突细胞(参见Stefansson K etal.，Nature 1982，29563-64；Stefansson K et al.，BrainRes.1982，234309-317)以及这些细胞产生的肿瘤(参见Tabuchi K et al.，Ac taNeurochir Wien 1982，65239-251)。抗S-100抗体还能附着到许多非黑色素瘤恶性肿瘤组织上(Drier JK et al.，Arch.Pathol.Lab.Med.，1987，111447-452)。 NKI/C3抗体也能作用于许多良性的或恶性的肿瘤，这种非特异性活性使NKI/C3抗体在黑色素瘤检测上的使用受到了很大的限制。 KBA.62抗体对于黑色素瘤的敏感性与HMB-45相似，但是它能够附着到鳞状细胞癌和基底细胞癌上，缺乏特异性(参见Cohen Knafo Eet al.，J Clin Pathol1984；37367-372)。 由此可见，虽然在国内外已经建立了许多针对黑色素瘤的单克隆抗体，但是这些单克隆抗体的特异性及中和能力均不够理想。因此，需要建立可以用于临床治疗的单克隆抗体以及人源化的高亲和力的单克隆抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种黑色素瘤特异性的单克隆抗体SM5-1，它对应的抗原分子量为220-240KD。将石蜡包埋的黑色素瘤(初级黑色素瘤和转移瘤)和皮肤痣试样进行免疫组织化学染色，结果显示SM5-1能够作用于所有的痣和恶性黑色素瘤。另一方面，SM5-1不与非活化的表皮黑素细胞、非黑素肿瘤细胞、角化细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和外周神经细胞作用。这些结果表明SM5-1对于黑色素瘤是高度敏感和特异性的。 本专利技术的单克隆抗体已经在美国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏号为ATCC No.HB-12588。 本专利技术还涉及一种分离的、纯化的或合成的抗原，能够特异性结合SM5-1的抗体。本专利技术所述的抗原存在于所有人黑色素瘤细胞的细胞膜和细胞质中，包括但不限于痣、初级黑色素瘤细胞和转移黑色素瘤细胞。另外，用SM5-1检测发现，该抗原在正常非活化的人黑色素细胞中是不存在的，在其它肿瘤细胞中也不存在。 本专利技术的抗原可用于制备一种黑色素瘤疫苗，能够引起黑色素瘤的特异性免疫应答，从而预防和治疗黑色素瘤。可将黑色素瘤抗原加入到一种佐剂形成药物组合物。使用的佐剂包括但不限于弗罗依德氏完全和不完全佐剂、矿物胶、表面活化底物。 如本专利技术所用，“分离的”限定的是一种从天然状态(如细胞，胞外物质)分离的或合成的多肽(抗原或抗体)，已经从正常的天然环境中脱离开来。该分离的多肽是独特的，区别于纯化的、天然分离的多肽。“纯化的”限定的是一种不是完全纯的多肽，比天然状态相对纯。 本专利技术还涉及一种能够识别SM5-1抗体识别抗原的亲合分子。这些亲合分子包括但不限于抗体、肽和其它能够特异性结合抗原的聚合物，其中优选的亲合分子是单克隆抗体。本专利技术中不同的单克隆抗体可以识别不同的抗原决定簇。本专利技术中优选的单克隆抗体是纯化的、分离的。 作为本专利技术的一种优选的单克隆抗体具备的条件是(1)能够识别痣、初级黑色素瘤细胞和转移黑色素瘤细胞抗原；(2)不能识别正常的非活化黑色素瘤细胞抗原(即不能与其任何一种抗原结合)；(3)不能识别其它的任何肿瘤细胞(即不能与其任何一种抗原结合)。 本专利技术所述的抗体可以是任何一种免疫球蛋白，比如IgA、IgG、IgD、IgE、IgM及其亚类，此外也可以是完整的抗体或抗体片段，包括但不限于FAB、F(ab)2’、Fv。 另外本专利技术还涉及与本专利技术的抗体具有相同结合特异性的抗体衍生物，这些衍生物在其抗原结合非关键区域上有所变更。 本专利技术的单克隆抗体也可以与其他的分子连接，特别是标记物和毒素，包括但不限于酶(如过氧化物酶)、毒素(如蓖麻蛋白或霍乱毒素)、荧光素和放射性标记物。 单克隆抗体可以由本
常规的细胞融合技术获得。抗体分泌细胞系也可以由融合技术以外的其它技术获得，比如用致癌的DNA、病毒直接转化B淋巴细胞。不同来源的抗原被用于激发正常的B淋巴细胞系，之后转变为无限增殖细胞系。比如，与SM5-1抗体发生免疫沉淀的抗原可作为免疫原刺激哺乳动物(如小鼠、大鼠、仓鼠等)。收集被抗原刺激的淋巴细胞，应用本
公知的技术融合到无限增殖细胞，或者转化入无限增殖细胞系。可以通过选择能够与抗原发生强反应的克隆筛选抗黑色素瘤细胞抗体产物；也可以通过选择与SM5-1竞争性结合黑色素瘤细胞和/或其分离的或纯化的抗原的克隆来筛选抗黑色素瘤细胞抗体产物。 本专利技术涉及的细胞系优选的是杂交瘤细胞系，另一种优选方式是无限增殖细胞系。 本专利技术中的单克隆抗体和其他亲和分子可用于分离黑色素瘤抗原(参见Harlow and Lane，“免疫纯化”，第511-552页)。 本专利技术中的单克隆抗体和其他亲和分子还可用于分离黑色素瘤细胞。因而本专利技术还提供一种大量生产富含人黑色素瘤细胞的细胞群的方法，包括选择一种预计包含黑色素瘤细胞的组织细胞悬浮液，将细胞悬浮液与能够识别SM5-1抗体识别抗原的单克隆抗体(或其它亲和分子)共悬浮，然后从细胞悬浮液中分离结合了抗体的细胞。 人的黑色素瘤细胞和表达其它SM5-1识别抗原的细胞可以使用本专利技术的抗体，通过间接免疫技术从其它细胞中分离，所用的技术包括荧光激活细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能够特异性结合人黑色素瘤细胞抗原的单克隆抗体，其中抗原：（ａ）能够被ＡＴＣＣ保藏号ＨＢ－１２５８８的杂交瘤产生的抗体结合；（ｂ）存在于人黑素细胞的膜和细胞质中；（ｃ）不存在于正常非活化的人黑色素细胞和非黑色素细胞肿瘤细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马菁，王皓，刘庆法，
申请(专利权)人：上海中信国健药业有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]