本发明专利技术公开了一种香菇菌丝体多糖的径向流色谱分离方法，包括步骤：将香菇菌丝体粉碎后通过脱脂，室温水提生物活性多糖、去蛋白、透析除盐、径向流色谱纯化和冷冻干燥；其中，径向流色谱纯化中所用洗脱液为Ｔｒｉｓ－盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、巴比妥－盐酸缓冲液中的一种；所用阴离子交换填料为配基基团为二乙氨乙基的琼脂糖凝胶。该分离方法不影响香菇菌丝体多糖天然结构及分离效果，得到的香菇菌丝体多糖含量高且保留了其生物活性，并能作为（如针剂等）药用原料；且工艺简短，能耗小，成本低，从而确保稳定、快速的多糖分离，便于工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及多糖的色谱分离
，具体涉及一种香菇菌丝体多糖的径向流色 谱分离方法。
技术介绍
香菇(Lentinula edodes)为担子菌纲白蘑科真菌，是世界名贵食用菌兼药用菌之 一。香菇内含丰富的活性多糖，现代科学研究证明，香菇多糖是一种非特异免疫刺激剂，具 有抑制肿瘤、抗病毒、抗氧化和增强免疫力等多方面的活性功能，且无任何毒副作用。采用深层发酵所得香菇菌丝体提取多糖，产量大，周期短，易控制，便于工业化生 产。目前多糖的分级纯化采用传统的轴流式柱中DEAE-纤维素(即二乙氨乙基纤维素) 吸附、洗脱的层析法，存在产品产量低，耗时长、分离效率低、压降大、中试放大困难等缺点， 一直是限制香菇多糖产业化开发和菌业精深加工发展的技术瓶颈问题。总之，国内对食药 用菌多糖的提取分离研究虽然已有一定规模和历史，但多停留在低水平重复和小规模试验 阶段，创新性技术很少，未能真正使多糖的分离在工业化生产中得以大规模的应用。为了解决上述问题，中国专利技术专利ZL 02138962. 4中公开了一种香菇菌多糖的分 离纯化工艺，该工艺采用一定分子量的超滤膜对香菇菌多糖进行分离，但由于膜包在分离 过程中容易阻塞，且操作压力大，能耗高，不适于工业化生产。申请号为CN200610116956. 3 的中国专利技术专利申请中公开了一种香菇多糖的分离纯化方法，该方法提供一种在层析柱中 不易堵塞，可批量生产的香菇多糖分离方法，但实际操作流速缓慢，不易线性放大。中国发 明专利ZL 200510017261. 5中公开了一种分离香菇多糖和香菇菌多糖的方法，该方法采用 聚乙二醇沉淀多糖，虽可简化流程，降低成本，但多糖得率较低，仍不能满足大规模的需求。径向流色谱法(Radical Flow Chromatography，RFC)是近些年发展起来的新型色 谱分离技术，它采用了径向流动技术，流动相携带样品沿径向迁移，不同于传统轴向色谱柱 的流体在柱内从一端流向另一端。在径向柱中，流动相和样品可以从色谱柱的周围流向柱 圆心，也可以从柱圆心流向柱周围。它的主要特点是(一)反压降较低，在相同的体积流速 下，尤其适当体积流速较高时，径向流色谱柱的柱压比传统轴向柱的柱压低得多；较低的反 压降，使径向流色谱可采用较高的流动相速度，从而样品出峰较快，同时对设备的要求也较 低。(二)便于线性放大，由于特殊的径向流流动设计，在只增加柱长、保持色谱柱直径不变 的情况下，即可线性增大样品处理量，即样品处理规模可在保持相似色谱条件下直接放大， 各组分保留时间及分辨情况基本相同。(三)分离效率高，为样品流动提供了较大的横截面 积，更高的体积流速，而且使样品在柱内暴露时间短，不仅有利于生物活性物质快速分离纯 化，而且能提高样品的回收率和最终产物的浓度。张正光等用径向阳离子交换柱从CL-CDl细胞培养上清液中分离纯化尿激酶原。 分离结果表明，PRO-UK的活性提高了 44. 3倍，蛋白质含量下降了 98%以上，体积缩小至 1/7，回收率达87. 7% (军事医学科学学院院刊，1997，2(21) :47_50)。郭立安等人利用径 向离子交换色谱技术从促性腺激素的粗提物中分离纯化了促卵泡激素，得到很好的分离结果，同时比较了径向离子交换色谱于经典离子交换色谱在纯化工艺放大过程中的分离 效果，证实径向流色谱比经典色谱更适合于促卵泡激素的纯化，并建立了适合大规模纯化 的新工艺(色谱，2000，18 (6) :577-579)。刘国诠利用CM径向柱分离小牛血清的结果是 经SDSPAGE证实，所分离的牛血清白蛋白基本为纯品，总蛋白回收率大于90% ；同时，他将 牛血清上样品增加6倍后，所得分离结果几乎完全相同(生物工程下游技术，1993)。孙 涛等用膜径向离子交换色谱分离凝血酶原复合物，该方法将流速从3ml/min提高到20ml/ min,且保持分离物质的生物活性(色谱，2000，18 (4) :350_352)。Gustavsson等采用琼脂 糖型连续床层亲和径向色谱柱分离乳酸脱氢酶，他们首次将凝胶填料直径从10 μ m放大 至Ij 60mm,而不影响分离效果(Per-Erik Gustavsson and Per-Olof Larsson, Journal of ChromatographyA,2001)。但径向色谱在多糖类产品的分离中尚未应用。
技术实现思路
本专利技术提供了一种快速、高效的香菇菌丝体多糖的径向流色谱分离方法，该分离 方法不影响香菇菌丝体多糖天然结构及分离效果，得到的香菇菌丝体多糖含量高且保留了 其生物活性，并能作为(如针剂等)药用原料。，包括步骤(1)脱脂将香菇菌丝体粉末用乙醇浸没进行脱脂，过滤得到滤渣，即脱脂后香菇 菌丝体粉末；(2)超声辅助水提将上述脱脂后香菇菌丝体粉末加入蒸馏水中形成料液，经超 声波提取、离心，所得上清液浓缩后加入乙醇，冷冻过夜，收集沉淀，即得香菇菌丝体粗多 糖；(3)去蛋白将上述香菇菌丝体粗多糖溶于蒸馏水中，加入氯仿与正丁醇混合液， 剧烈混合后，离心除去蛋白，得到水提液；(4)透析将上述水提液装入透析袋中依次在流水和去离子水中透析，收集透析 袋中的液体，得到香菇菌丝体多糖液；(5)径向流色谱纯化将上述香菇菌丝体多糖液用洗脱液配成溶液，离心后取上 清液，将上清液流过装有阴离子交换填料的径向流色谱柱，用洗脱液进行线性梯度洗脱，收 集洗脱液，每至多15mL收集一次(优选每6mL IOmL收集一次)，用苯酚-硫酸法检测 各洗脱液中的多糖出峰，绘制洗脱曲线，分离出2个组分，分别收集后浓缩，得到第一组分 和第二组分；第一组分的分子量一般为120000Da 140000Da，第二组分的分子量一般为 160000Da 170000Da ；其中，所述的洗脱液选用pH6. 5 8. 5的Tris-盐酸缓冲液、pH6. 8 9. 0巴比 妥-盐酸缓冲液、PH6.0 8.0的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)中的一种。所述的阴离子交换填料为配基基团为二乙氨乙基的糖凝胶，可选用DEAE Sepharose FF、DEAE-32、DEAE-52、DEAE-Sephacel 等通用市售填料中的一种，如 GE 公司的 阴离子交换填料DEAE系列。(6)冷冻干燥将上述第一组分和第二组分分别在蒸馏水中透析，再经0.45 μ m 滤膜过滤后冷冻干燥，相应地得到白色粉末状的第一香菇菌丝体多糖和第二香菇菌丝体多 糖。本专利技术分离得到的第一香菇菌丝体多糖和第二香菇菌丝体多糖均为中性多糖。所述的Tris-盐酸缓冲液即三羟甲基氨基甲烷_盐酸缓冲液，其配制方法按照本 领域通用的方法，一般可参照2005年版《中国药典》。所述的磷酸盐缓冲液和巴比妥_盐酸缓冲液的配制方法按照本领域通用的方法， 一般可参照2005年版《中国药典》。为了达到更好地分离效果，优选步骤(1)中，所述的香菇菌丝体粉末为过50 120目筛的粉末；所述的脱脂温度为15°C 35°C，脱脂时间为20h 30h。步骤(1)的脱脂过程重复的次数为1次 3次。步骤(2)中，所述的脱脂后香菇菌丝体粉末的克数与蒸馏水的毫升数之比为 1 5 20。所述的超声波提取的温度为50°C 80°C，功率为8KHz 20KHz，时间为0. 5h 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种香菇菌丝体多糖的径向流色谱分离方法，包括步骤： （１）脱脂：将香菇菌丝体粉末用乙醇浸没进行脱脂，过滤得到滤渣，即脱脂后香菇菌丝体粉末； （２）超声辅助水提：将上述脱脂后香菇菌丝体粉末加入蒸馏水中形成料液，经超声波提取、离心，所得上清液浓缩后加入乙醇，冷冻过夜，收集沉淀，即得香菇菌丝体粗多糖； （３）去蛋白：将上述香菇菌丝体粗多糖溶于蒸馏水中，加入氯仿与正丁醇混合液，剧烈混合后，离心除去蛋白，得到水提液； （４）透析：将上述水提液装入透析袋中依次在流水和去离子水中透析，收集透析袋中的液体，得到香菇菌丝体多糖液； （５）径向流色谱纯化：将上述香菇菌丝体多糖液用洗脱液配成溶液，离心后取上清液，将上清液流过装有阴离子交换填料的径向流色谱柱，用洗脱液进行线性梯度洗脱，收集洗脱液，每至多１５ｍＬ收集一次，用苯酚－硫酸法检测各洗脱液中的多糖出峰，绘制洗脱曲线，分离出２个组分，分别收集后浓缩，得到分子量为１２００００Ｄａ～１４００００Ｄａ的第一组分和分子量为１６００００Ｄａ～１７００００Ｄａ的第二组分； 其中，所述的洗脱液为ｐＨ６．５～８．５的Ｔｒｉｓ－盐酸缓冲液、ｐＨ６．８～９．０巴比妥－盐酸缓冲液、ｐＨ６．０～８．０的磷酸盐缓冲液中的一种； 所述的阴离子交换填料为配基基团为二乙氨乙基的琼脂糖凝胶； （６）冷冻干燥：将上述第一组分和第二组分分别在蒸馏水中透析，再经０．４５μｍ滤膜过滤后冷冻干燥，相应地得到白色粉末状的第一香菇菌丝体多糖和第二香菇菌丝体多糖。...
【技术特征摘要】
一种香菇菌丝体多糖的径向流色谱分离方法，包括步骤(1)脱脂将香菇菌丝体粉末用乙醇浸没进行脱脂，过滤得到滤渣，即脱脂后香菇菌丝体粉末；(2)超声辅助水提将上述脱脂后香菇菌丝体粉末加入蒸馏水中形成料液，经超声波提取、离心，所得上清液浓缩后加入乙醇，冷冻过夜，收集沉淀，即得香菇菌丝体粗多糖；(3)去蛋白将上述香菇菌丝体粗多糖溶于蒸馏水中，加入氯仿与正丁醇混合液，剧烈混合后，离心除去蛋白，得到水提液；(4)透析将上述水提液装入透析袋中依次在流水和去离子水中透析，收集透析袋中的液体，得到香菇菌丝体多糖液；(5)径向流色谱纯化将上述香菇菌丝体多糖液用洗脱液配成溶液，离心后取上清液，将上清液流过装有阴离子交换填料的径向流色谱柱，用洗脱液进行线性梯度洗脱，收集洗脱液，每至多15mL收集一次，用苯酚 硫酸法检测各洗脱液中的多糖出峰，绘制洗脱曲线，分离出2个组分，分别收集后浓缩，得到分子量为120000Da～140000Da的第一组分和分子量为160000Da～170000Da的第二组分；其中，所述的洗脱液为pH6.5～8.5的Tris 盐酸缓冲液、pH6.8～9.0巴比妥 盐酸缓冲液、pH6.0～8.0的磷酸盐缓冲液中的一种；所述的阴离子交换填料为配基基团为二乙氨乙基的琼脂糖凝胶；(6)冷冻干燥将上述第一组分和第二组分分别在蒸馏水中透析，再经0.45μm滤膜过滤后冷冻干燥，相应地得到白色粉末状的第一香菇菌丝体多糖和第二香菇菌丝体多糖。2.根据权利要求1所述的香菇菌丝体多糖的径向流色谱分离方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的香菇菌丝体粉末为过50 120目筛的粉末； 所述的脱脂温度为15°C 35°C，脱脂时间为20h 30h ； 步骤(1)的脱脂过程重复的次数为1次 3次。3.根据权利要求1所述的香菇菌丝体多糖的径向流色谱分离方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的脱脂后香菇菌丝体粉末的克数与蒸馏水的毫升数之比为1 5 20。4.根据权利要求1或3所述的香菇菌丝体多糖的径向流色谱分离方法，其特征在于，步 骤(2)...
【专利技术属性】
技术研发人员：贺亮，吴学谦，程俊文，李卫旗，吴庆其，李海波，魏海龙，
申请(专利权)人：浙江省林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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