蛋白类药物中唾液酸的检测方法技术

本发明专利技术提供了蛋白类药物中唾液酸的检测方法。具体地，本发明专利技术提供了一种对蛋白的唾液酸含量进行检测的方法，所述方法包括步骤：(1)提供一待分析样品，其中含有待分析蛋白；(2)对步骤(1)中的样品进行酸水解，得到酸水解产物；(3)对(2)中所述的酸水解产物用标记试剂进行标记，获得经标记的混合物；(4)用有机溶剂对所述经标记的混合物进行色谱预处理，获得预处理的混合物；(5)将所述预处理的混合物上样于亲水相互作用色谱柱，进行色谱分离，获得含标记的唾液酸的洗脱液；(6)对所述的洗脱液进行检测，从而获得所述蛋白的唾液酸含量的测定结果。

Method for detecting sialic acid in protein drugs

The present invention provides a method for detecting sialic acid in a protein drug. Specifically, the present invention provides a protein of the sialic acid content detection method, the method includes the steps of: (1) provide a sample to be analyzed, which contains the protein to be analyzed; (2) to step (1) samples of acid hydrolysis, acid hydrolysis products; (3) on (2) in the acid hydrolysis products of the labeled with labeling reagent, obtained by labeling mixture; (4) with organic solvent, the mixture of labeled chromatography pretreatment, mixture pretreatment; (5) the mixture of the pretreated sample in hydrophilic interaction chromatography column chromatographic separation was obtained with labeled sialic acid eluate; (6) of the eluent were detected, so as to obtain the determination results of sialic acid content of the protein.

【技术实现步骤摘要】
蛋白类药物中唾液酸的检测方法
本专利技术涉及质控检测领域，具体地涉及蛋白类药物中唾液酸的检测方法。
技术介绍
唾液酸(SA)是一类神经氨酸的衍生物，一个含有9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖，系统命名为5-氨基-3,5二脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖。根据5号碳上不同的连接基团，构成了不同的唾液酸衍生物。最主要的两种唾液酸为5-乙酰氨基-3,5-二脱氧-D-半乳壬酮糖(NANA，Neu5Ac，N-乙酰神经氨酸)和3-脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖(KDN)，其余的唾液酸均是由这两种衍生而成。而N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)是NANA的乙酰基位置上发生了羟基化而得到的。NGNA和NANA通常以低聚糖，糖脂或者糖蛋白的形式存在。唾液酸修饰与蛋白类药物的安全性及有效性息息相关，对唾液酸进行准确定量监测既能监控生产工艺的稳定性，同时又利于药物的质量控制。目前唾液酸检测方法主要分为两类，第一种参考药典方法，取适量蛋白样品，加入一定浓度的硫酸或其他酸性试剂，高温条件下将唾液酸水解，之后离心取上清采用阴离子交换色谱柱进行分离紫外检测，进行定量。这种方法灵敏度较低，对于目前的药物蛋白具有很大的局限性，仅能对一些唾液酸含量高的融合蛋白进行检测。对于唾液酸含量较少的蛋白无法准确定量，尤其对于占据生物药市场半壁江山的抗体类药物无法采用该方法进行唾液酸准确定量。第二种方法为采用DMB(4,5-亚甲二氧基-1,2-苯二胺二盐酸盐)荧光标记，采用反相色谱柱，流动相选择ACN/MeOH/H2O9/7/84等度分离，之后激发波长373nm，发射波长448nm检测外标定量。然而，该方法不仅成本高，而且存在以下缺点：1)处理后的样品含有干扰物质(如无法彻底去除蛋白)，会显著缩短色谱柱的寿命；(2)即使采用离心方式也无法充分去除蛋白，而采用溶剂处理，则会在色谱分离时产生溶剂效应；(3)每次样品分析后需要较长时间的色谱柱冲洗；(4)标记试剂与杂质峰可能会影响唾液酸分离及鉴定，标准品保留时间会发生漂移，重现性不好，方法的耐受性较差。综上所述，本领域尚缺乏令人满意的高准确性和高灵敏度的对蛋白类药物中唾液酸进行检测的方法。因此，本领域迫切需要开发新的、高准确性和高灵敏度的对蛋白类药物中唾液酸进行检测的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高准确性和高灵敏度的对蛋白类药物中唾液酸进行检测的方法。在本专利技术的第一方面，提供了一种对蛋白的唾液酸含量进行检测的方法，包括步骤：(1)提供一待分析样品，其中含有待分析蛋白；(2)对步骤(1)中的样品进行酸水解，得到酸水解产物；(3)对(2)中所述的酸水解产物用标记试剂进行标记，获得经标记的混合物；(4)用有机溶剂对所述经标记的混合物进行色谱预处理，获得预处理的混合物；(5)将所述预处理的混合物上样于亲水相互作用色谱柱，进行色谱分离，获得含标记的唾液酸的洗脱液；(6)对所述的洗脱液进行检测，从而获得所述蛋白的唾液酸含量的测定结果。在另一优选例中，所述方法的唾液酸检测信噪比大于3(如3-500，较佳地3-200，更佳地4-50，较佳地5-20)。在另一优选例中，所述步骤(6)中，包括对将样品的检测结果与标准曲线或标准品进行比较，从而获得所述蛋白的唾液酸含量的测定结果。在另一优选例中，所述的样品体积≥25微升，如25-2000微升，较佳地50-1500微升。在另一优选例中，所述的样品中，蛋白量含量≥50μg，优选500μg。在另一优选例中，所述方法的检测灵敏度达到10pmol或更低。在另一优选例中，对于10pmol的样品，唾液酸检测信噪比大于3。在另一优选例中，所述方法中，步骤(2)之后，步骤(3)之前还包括瞬离步骤。在另一优选例中，所述方法中，步骤(4)之后，步骤(5)之前还包括振荡混匀步骤。在另一优选例中，所述方法中，步骤(4)之后，步骤(5)之前还包括离心步骤。在另一优选例中，所述方法中，所述离心步骤为5000-20000rpm离心1-15分钟，如13000r/min离心5分钟。在另一优选例中，步骤(2)中所述酸水解所用酸选自下组：乙酸、三氟乙酸、硫酸、盐酸、甲酸、三氯乙酸、磷酸、硝酸。在另一优选例中，所述方法中，步骤(2)中所述酸水解中，所用酸的终浓度为1-3M，较佳地为2M。在另一优选例中，所述方法中，步骤(2)中酸水解的反应条件为65-85℃反应1-4小时，较佳地为70-80℃反应1.5-3小时，更佳地为70-80℃反应2小时，又更佳地为80℃反应2小时。在另一优选例中，所述方法中，步骤(3)中标记的反应条件为40-60℃避光反应1-3小时，较佳地为40-60℃避光反应1.5-2.5小时，更佳地在约50±2℃避光反应2±0.5小时，又更佳地在50℃避光反应2小时。在另一优选例中，所述待分析蛋白为抗体蛋白。在另一优选例中，所述待分析蛋白为单抗蛋白。在另一优选例中，所述待分析蛋白为融合蛋白。在另一优选例中，所述标记试剂选自：4,5-亚甲二氧基-1,2-苯二胺二盐酸盐(DMB)，或具有式I结构的标记化合物：式中，化合物1，X＝O，R＝CH3；化合物2，X＝O，R＝化合物3，X＝NH，R＝H；化合物4，X＝NH，R＝CH3；化合物5，X＝NH，R＝化合物6，X＝NH，R＝在另一优选例中，所述有机溶剂选自下组：乙腈、甲醇、乙醇、DMSO、异丙醇、或其组合。在另一优选例中，所述有机溶剂(预处理剂)选自下组：乙腈、含乙腈的混合溶剂。在另一优选例中，在预处理步骤中，有机溶剂(预处理剂)的用量为60％-95％(终浓度)，较佳地为80％，按预处理混合物的总体积计。在另一优选例中，所述分析方法不包括脱盐步骤。在另一优选例中，所述的方法为产品质量控制方法。在另一优选例中，所述的方法为特性研究方法。在另一优选例中，所述的方法为非诊断性和非治疗性的方法。在另一优选例中，所述色谱柱为BEHamide柱。在另一优选例中，所述BEHamide柱为聚糖BEHamide柱，例如WatersGlycanBEHAmide柱。在另一优选例中，所述色谱分析的参数流速为0.1-0.8ml/min，较佳地为0.2-0.6ml/min，更佳地为0.4ml/min。在另一优选例中，所述色谱分析的参数检测波长为ex＝373nmem＝448nm。在另一优选例中，所述色谱分析的参数运行时间为8-20分钟，较佳地为12分钟。在另一优选例中，所述色谱分析的参数进样量为0.2-15μl，较佳地为5μl。在另一优选例中，所述色谱分析的参数进样盘温度为10℃以下，较佳地为4℃。在另一优选例中，所述色谱分析的流动相包含水相和有机溶剂。在另一优选例中，所述水相中添加有缓冲盐。在另一优选例中，所述水相的起始比例不高于40％，最佳地为15％。在另一优选例中，所述色谱分析的流动相中的有机溶剂选自：甲醇、乙醇、丙醇、乙腈、或其组合。在另一优选例中，所述色谱分析的流动相为水和乙腈。在另一优选例中，所述色谱分析的流动相为水和甲醇。在另一优选例中，所述色谱分析的流动相为水和乙醇。在另一优选例中，所述色谱分析的流动相为水和丙醇。在本专利技术的第二方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：(1)酸水解试剂；(2)标记试剂；(3)任选的标准品和/或标准曲线，所述标准品选自NGNA、NA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对蛋白的唾液酸含量进行检测的方法，其特征在于，包括步骤：(1)提供一待分析样品，其中含有待分析蛋白；(2)对步骤(1)中的样品进行酸水解，得到酸水解产物；(3)对(2)中所述的酸水解产物用标记试剂进行标记，获得经标记的混合物；(4)用有机溶剂对所述经标记的混合物进行色谱预处理，获得预处理的混合物；(5)将所述预处理的混合物上样于亲水相互作用色谱柱，进行色谱分离，获得含标记的唾液酸的洗脱液；(6)对所述的洗脱液进行检测，从而获得所述蛋白的唾液酸含量的测定结果。

【技术特征摘要】
1.一种对蛋白的唾液酸含量进行检测的方法，其特征在于，包括步骤：(1)提供一待分析样品，其中含有待分析蛋白；(2)对步骤(1)中的样品进行酸水解，得到酸水解产物；(3)对(2)中所述的酸水解产物用标记试剂进行标记，获得经标记的混合物；(4)用有机溶剂对所述经标记的混合物进行色谱预处理，获得预处理的混合物；(5)将所述预处理的混合物上样于亲水相互作用色谱柱，进行色谱分离，获得含标记的唾液酸的洗脱液；(6)对所述的洗脱液进行检测，从而获得所述蛋白的唾液酸含量的测定结果。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述酸水解所用酸选自下组：乙酸、三氟乙酸、硫酸、盐酸、甲酸、三氯乙酸、磷酸、硝酸。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待分析蛋白为抗体蛋白。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待分析蛋白为融合蛋白。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记试剂选自：4,5-亚甲二氧基-1,2-苯二胺二盐酸盐(DMB)，或具有式I结...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢伟博，
申请(专利权)人：信达生物制药苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32