ＵＤＰ－葡萄糖基转移酶突变体的编码基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种ＵＤＰ－葡萄糖基转移酶突变体的编码基因及其应用。本发明专利技术提供的蛋白质，人工合成，命名为ＲｓｍＵＧＴ７３Ｂ６，是如下１）或２）的蛋白质：１）由序列表中的序列３的氨基酸残基序列组成的蛋白质；２）将序列表中的序列４氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且与红景天甙合成相关由１）衍生的蛋白质。本发明专利技术的实验证明，采用定点突变（Ｖ３６１Ｔ／Ｔ３７３Ｉ／Ｇ３７６Ｓ）技术对ＵＧＴ７３Ｂ６进行了突变研究，ＵＧＴ７３Ｂ６的三联体突变体命名为ＲｓｍＵＧＴ７３Ｂ６，结果显示，突变后的ＲｓｍＵＧＴ７３Ｂ６红景天甙合成能力较ＵＧＴ７３Ｂ６提高了１．９倍。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种UDP-葡萄糖基转移酶突变体的编码基因及其应用。
技术介绍
高山红景天(Rhodiola sachalinensis A. Bor)又名库页红景天，是景天科 (Crassulaceae)红景天属(Rhodiola rosea L.)植物，为多年生草本或亚灌木，常具肉 质匍匐根状茎，是长白山珍稀药用植物之一。红景天属植物的主要活性成分为红景天甙 (salidroside)和甙元酪醇(tyrosol)等，现代药理学研究结果表明红景天甙具有明显的 抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗辐射、抗病毒、延缓机体衰老等功效，对于航天、深海、沙漠、高 原、体育等行业是一种极具开发应用前景的环境适应药物，同时对高辐射从业人员、微机使 用频繁人员、强脑力劳动者、中老年人群具有积极的滋补保健作用。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种UDP葡萄糖基转移酶突变体的编码基因及其应用。本专利技术提供的蛋白质，人工合成，命名为RsmUGT73B6，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中的序列4的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将序列表中的序列4氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且具有UDP-葡萄糖基转移酶功能和/或与红景天甙合成相关的由1)衍生 的蛋白质。上述序列4由480个氨基酸残基组成，上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。所述蛋白质的编码基因RsmUGT73B6也是本专利技术保护的范围。所述编码基因为如下1) -5)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列3所示的DNA分子；2)序列表中序列3自5’末端第1位到第1443位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列3自5’末端第4位到第1443位核苷酸所示的DNA分子；4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码具有UDP-葡萄糖基 转移酶功能和/或与红景天甙合成相关的蛋白所示的DNA分子；5)与1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、 至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有 98%或至少具有99%同源性且编码具有UDP-葡萄糖基转移酶功能和/或与红景天甙合成 相关的蛋白所示的DNA分子。上述序列3由1564个核苷酸组成，OFR的序列为序列3的自5，末端第1-1443位 核苷酸序列。所述严格条件可为在0. IXSSPE(或0. 1XSSC)，0. 1 % SDS的溶液中，在65°C下杂 交，并用该溶液洗膜。含有上述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、表达盒或重组病毒也是本 专利技术保护的范围。所述重组载体为将上述编码基因插入载体pET_30b (+)的NdeI和SalI识别位点 间得到的重组载体。扩增上述编码基因全长或任一片段的引物对也是本专利技术保护的范围；所述引物对 如下所示一条引物序列如序列表中序列5所示，另一条引物序列如序列表中序列6所示。上述蛋白质在合成红景大甙中的应用，上述编码基因在合成红景天甙中的应用都 是本专利技术要保护的范围。所述合成红景天甙为体外合成红景天甙。本专利技术的另一个目的是提供一种制备苯亚甲基丙酮的方法。本专利技术提供的方法为以酪醇和UDP-葡萄糖为底物，在权利要求1所述蛋白质的催 化作用下，得到红景天甙。本专利技术的实验证明，采用定点突变(V361T/T373I/G376S)技术对UGT73B6进行了 突变研究，UGT73B6的三联体突变体命名为RsmUGT73B6，结果显示，突变后的RsmUGT73B6红 景天甙合成能力较UGT73B6提高了 1.9倍。RsmUGT73B6突变基因及其应用为红景天甙的生 物合成提供了直接有效的技术及应用基础。附图说明图1为RsmUGT73B6原核表达载体的构建图2为原核表达载体的NdeI和BamHI双酶切鉴定图3为UGT纯化SDS-PAGE分析图4为HPLC检测结果具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、UGT73B6的定点突变的获得1. UGT73B6的定点突变人工合成UGT73B6 (序列表中的序列1)。UGT73B6 的定点突变(V361T/T373I/G376S)采用 QuikChange site-directed mutagenesis kit (购自Stratagene，Catalog#200518)试剂盒方法，具体突变引物如下(突 变位点用下划线标出)UGT73B6 V361T/T373I/G376S(5，-GGACCACCAGTCT ACCGGGGGTTTT GTGTCACATTGTGGATGGAACTCAATTTTGGAAAGTATCTCAGCAGGG-3’ )，模板为人工合成 UGT73B6， 进行PCR得到的PCR产物，将该PCR产物送去测序，结果表明，该PCR产物具有序列表中序 列2的序列，该PCR产物的基因命名为RsmUGT73B6，OFR为序列表中序列3的自5，末端第 1-1443位核苷酸，RsmUGT73B6编码的蛋白命名为RsmUGT73B6，该蛋白的氨基酸序列为序列 表中的序列4。RsmUGT73B6与UGT73B6相比，突变位点为第1081-1083位由GTG突变为 ACC，第 1117-1119 位由 ACA 突变为 ATT，第 1126-1128 位由 GGT 突变为 AGT。RsmUGT73B6 与UGT73B6(序列2)相比，突变位点为第361位由Val (缬氨酸)突变为Thr(苏氨酸)，第 373位由Thr (苏氨酸)突变为IIe (异亮氨酸)，第376位由甘氨酸Gly突变为Ser (丝氨酸)。2. RsmUGT73B6异源表达和蛋白纯化RsmUGT73B6cDNA的ORF使用含有特定限制性内切酶位点的N-末端和C-末端引 物进行 PCR 扩增。正义引物为5，-GGAATTCCATATGGGTTCTGAAACTCGGCC-3，(序列 5)，下 划线表示 NdeI 酶切位点；反义引物为5，-CGGGATCCCTAGACTTTCTTTAACTTGAGTTCC-3’ (序 列6)，下划线表示BamHI酶切位点。以步骤1)获得的PCR产物(或人工合成的序列3) 为模板，进行PCR，得到的PCR产物(序列2中自5’末端第4-1443为核苷酸序列)经 过Ndel/BamHI双酶切后，连接到经过相同酶切的原核表达载体pET_30b (+) (Novagen, Darmstadt, Germany)上，获得重组载体(图1为载体结构示意图)，将重组载体进行酶切 鉴定，结果如图2(M，DL15000+2000Marker ;1-3，阳性质粒。)所示，从图中看出，得到约 1. 5Kb的DNA片段，将酶切鉴定结果正确的重组阳性质粒测序，测序正确的重组载体命名为 pET-30b (+) -RsmUGT73B60 经过测序，pET_30b (+) -RsmUGT73B6 为在 pET_30b (+)的 NdeI 和 BamHI识别位点间插入序列2中自5’末端第4-1443为核苷酸序列得到的，进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质，是如下１）或２）的蛋白质：　　１）由序列表中的序列４的氨基酸残基序列组成的蛋白质；　　２）将序列表中的序列４氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且具有ＵＤＰ－葡萄糖基转移酶功能和／或与红景天甙合成相关的由１）衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
一种蛋白质，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中的序列4的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将序列表中的序列4氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有UDP 葡萄糖基转移酶功能和/或与红景天甙合成相关的由1)衍生的蛋白质。2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因为如下1)-5)中任一 所述的DNA分子1)序列表中序列3所示的DNA分子；2)序列表中序列3自5’末端第1位到第1443位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列3自5’末端第4位到第1443位核苷酸所示的DNA分子；4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码具有UDP-葡萄糖基转移 酶功能和/或与红景天甙合成相关的蛋白所示的DNA分子；5)与1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至 少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、...

【专利技术属性】
技术研发人员：王有年，马兰青，师光禄，叶和春，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]