利用ＵＧＴ７２Ｂ１４制备红景天甙的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用ＵＧＴ７２Ｂ１４制备红景天甙的方法。本发明专利技术提供的方法，包括如下步骤：１）将ＵＧＴ７２Ｂ１４蛋白的编码基因导入目的植物，得到转基因愈伤组织；２）从所述转基因愈伤组织中提取红景天甙，得到红景天甙；所述ＵＧＴ７２Ｂ１４蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列２。所述ＵＧＴ７２Ｂ１４蛋白的编码基因是通过重组植物表达载体导入所述目的植物的；所述重组植物表达载体为将所述ＵＧＴ７２Ｂ１４蛋白的编码基因插入载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１的多克隆位点间得到的。本发明专利技术为利用高山红景天转基因愈伤组织过表达红景天甙生物合成途径关键酶－ＵＧＴ７２Ｂ１４提供了具有创新性和实用性的相关技术方法及应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用UGT72B14制备红景天甙的方法。
技术介绍
高山红景天(Rhodiola sachalinensis A. Bor)又名库页红景天，是景天科 (Crassulaceae)红景天属(Rhodiola rosea L.)植物，为多年生草本或亚灌木，常具肉 质匍匐根状茎，是长白山珍稀药用植物之一。红景天属植物的主要活性成分为红景天甙 (salidroside)和甙元酪醇(tyrosol)等，现代药理学研究结果表明红景天甙具有明显的 抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗辐射、抗病毒、延缓机体衰老等功效，对于航天、深海、沙漠、高 原、体育等行业是一种极具开发应用前景的环境适应药物，同时对高辐射从业人员、微机使 用频繁人员、强脑力劳动者、中老年人群具有积极的滋补保健作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用UGT72B14制备红景天甙的方法。本专利技术提供的一种制备红景天甙的方法，包括如下步骤将UGT72B14蛋白的编码 基因导入目的植物的外植体，得到转基因愈伤组织；2)从所述转基因愈伤组织中提取红景 天甙，得到红景天甙；所述UGT72B14蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。上述序列2由473个氨基酸组成。所述UGT72B14蛋白的编码基因通过重组根癌农杆菌介导导入目的植物的外植 体；所述UGT72B14蛋白的编码基因通过重组植物表达载体导入目的植物的外植体。所述重组根癌农杆菌为将所述重组植物表达载体导入宿主农杆菌得到的重组根 癌农杆菌；所述重组植物表达载体为将所述UGT72B14蛋白的编码基因插入载体 PCAMBIA1301的BgLII和Bst EII识别位点间得到的。将所述UGT72B14蛋白的编码基因导入目的植物的外植体，得到转基因愈伤组织 的方法包括如下步骤用重组根癌农杆菌侵染所述目的植物的外植体，再依次进行共培养、 抑菌培养、诱导培养、抗性筛选培养和继代抗性筛选培养；所述重组根癌农杆菌为将所述重 组植物表达载体导入宿主农杆菌得到的重组根癌农杆菌。所述用重组根癌农杆菌侵染所述目的植物的外植体的步骤中，所述侵染的时间为 9分钟。所述外植体为叶盘。从叶片上通过打孔器打下来的小圆片即为叶盘，可用于转基因转染。所述共培养所用的培养基按照如下方法制备向MS培养基中添加6-苄氨基嘌呤、 1-萘乙酸和2，4_二氯苯氧乙酸丁酯，得到所述共培养所用的培养基，所述6-苄氨基嘌呤在 所述共培养所用的培养基中的浓度为1. 5mg/L，所述1-萘乙酸在所述共培养所用的培养基中的浓度为0. 15mg/L,所述2，4- 二氯苯氧乙酸丁酯在所述共培养所用的培养基中的浓度 为 0. 5mg/L ；所述抑菌培养所用的培养基按照如下方法制备向MS培养基中添加6-苄氨基嘌 呤、1-萘乙酸和头孢霉素，得到所述抑菌培养所用的培养基，所述6-苄氨基嘌呤在所述抑 菌培养所用的培养基中的浓度为1. 5mg/L，所述1-萘乙酸在所述抑菌培养所用的培养基中 的浓度为0. 15mg/L，所述头孢霉素在所述抑菌培养所用的培养基中的浓度为500mg/L ；所述诱导培养所用的培养基按照如下方法制备向MS培养基中添加6-苄氨基嘌 呤、1-萘乙酸、潮霉素和头孢霉素，得到所述诱导培养所用的培养基，所述6-苄氨基嘌呤在 所述诱导培养所用的培养基中的浓度为1. 5mg/L，所述1-萘乙酸在所述诱导培养所用的培 养基中的浓度为0. 15mg/L，所述潮霉素在所述诱导培养所用的培养基中的浓度为5mg/L， 所述头孢霉素在所述诱导培养所用的培养基中的浓度为500mg/L ；所述抗性筛选培养的培养基按照如下方法制备向MS培养基中添加6-苄氨基嘌 呤、1-萘乙酸、潮霉素和头孢霉素，得到所述抗性筛选培养的培养基，所述6-苄氨基嘌呤在 所述抗性筛选培养的培养基中的浓度为1. 5mg/L，所述1-萘乙酸在所述抗性筛选培养的培 养基中的浓度为0. 15mg/L，所述潮霉素在所述抗性筛选培养的培养基中的浓度为20mg/L， 所述头孢霉素在所述抗性筛选培养的培养基中的浓度为500mg/L ；每IOOOml所述共培养所用的培养基按照如下方法配制700mlMS液体培养基中加 入1.5ml6-苄氨基嘌呤母液、0. 15mll-萘乙酸母液、0.5ml 2，4-二氯苯氧乙酸丁酯母液后， 蒸馏水定容至1000ml，得到所述共培养用的培养基；每IOOOml所述抑菌培养所用的培养基按照如下方法配制700mlMS液体培养基中 加入1. 5ml6-苄氨基嘌呤母液、0. 15mll-萘乙酸母液、5. Oml头孢霉素母液后，蒸馏水定容 至1000ml，得到所述抑菌培养所用的培养基；每IOOOml所述诱导培养所用的培养基按照如下方法配制700mlMS液体培养基中 加入1. 5ml6-苄氨基嘌呤母液、0. 15mll-萘乙酸母液、0. 05ml潮霉素母液、5. Oml头孢霉素 母液后，蒸馏水定容至1000ml，得到所述诱导培养所用的培养基；每IOOOml所述抗性筛选培养的培养基按照如下方法配制700mlMS液体培养基中 加入1. 5ml6-苄氨基嘌呤母液、0. 15mll-萘乙酸母液、0. 2ml潮霉素母液、5. Oml头孢霉素母 液后，蒸馏水定容至1000ml，得到所述抗性筛选培养的培养基；所述共培养的时间为3天，所述共培养的温度为25°C，所述共培养为连续光照；所述抑菌培养的时间为5天，所述抑菌培养的温度为25°C，所述抑菌培养为连续 光照；所述诱导培养的时间为2周，所述诱导培养的温度为25°C，所述诱导培养为连续 光照；所述抗性筛选培养的时间为10周，所述抗性筛选培养的温度为25°C，所述抗性筛 选培养为连续光照；所述继代抗性筛选培养的方法为依次按照如下I和II所示步骤进行培养I 在连续光照、25°C，在如下培养基中继代3次培养，I所用的培养基按照如下方 法配制向MS培养基中添加6-苄氨基嘌呤、1-萘乙酸、潮霉素和头孢霉素，得到I所用的 培养基，所述6-苄氨基嘌呤在I所用的培养基中的浓度为1. 5mg/L，所述1-萘乙酸在I所5用的培养基中的浓度为0. 15mg/L，所述潮霉素在I所用的培养基中的浓度为15mg/L，所述 头孢霉素在I所用的培养基中的浓度为500mg/L ；II 在连续光照、25°C，在如下培养基中继代2次培养，II所用的培养基按照如下 方法配制向MS培养基中添加6-苄氨基嘌呤、1-萘乙酸、潮霉素和头孢霉素，得到II所用 的培养基，所述6-苄氨基嘌呤在II所用的培养基中的浓度为1. 5mg/L,所述1-萘乙酸在II 所用的培养基中的浓度为0. 15mg/L，所述潮霉素在II所用的培养基中的浓度为10mg/L，所 述头孢霉素在II所用的培养基中的浓度为500mg/L。I 每IOOOml所用的培养基按照如下方法配制700mlMS液体培养基中加入 1. 5ml6-苄氨基嘌呤母液、0. 15mll-萘乙酸母液、0. 15ml潮霉素母液、5. Oml头孢霉素母液 后，蒸馏水定容至1000ml，得到I所用的培养基；所述步骤I中，所述继代3次按照每10-13 天的间隔进行继代；II 每IOOOml所用的培养基按照如下方法配制700mlMS液体培养基中加入 1.5ml6-苄氨基嘌呤母液、0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备红景天甙的方法，包括如下步骤：１）将ＵＧＴ７２Ｂ１４蛋白的编码基因导入目的植物的外植体，得到转基因愈伤组织；２）从所述转基因愈伤组织中提取红景天甙，得到红景天甙；所述ＵＧＴ７２Ｂ１４蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列２。

【技术特征摘要】
一种制备红景天甙的方法，包括如下步骤1)将UGT72B14蛋白的编码基因导入目的植物的外植体，得到转基因愈伤组织；2)从所述转基因愈伤组织中提取红景天甙，得到红景天甙；所述UGT72B14蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述UGT72B14蛋白的编码基因通过重组根癌农杆菌介导导入目的植物的外植体；所述UGT72B14蛋白的编码基因通过重组植物表达载体导入目的植物的外植体。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述重组根癌农杆菌为将所述重组植物表达载体导入宿主农杆菌得到的重组根癌农 杆菌；所述重组植物表达载体为将所述UGT72B14蛋白的编码基因插入载体pCAMBIA1301的 多克隆位点间得到的。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于将所述UGT72B14蛋白的编码基 因导入目的植物的外植体，得到转基因愈伤组织的方法包括如下步骤用重组根癌农杆菌 侵染所述目的植物的外植体，再依次进行共培养、抑菌培养、诱导培养、抗性筛选培养和继 代抗性筛选培养。5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述用重组根癌农杆菌侵染所 述目的植物的外植体的步骤中，所述侵染的时间为9分钟。6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述外植体为叶盘。7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述共培养所用的培养基按照如下方法制备向MS培养基中添加6-苄氨基嘌呤、 1-萘乙酸和2，4- 二氯苯氧乙酸丁酯，得到所述共培养所用的培养基，所述6-苄氨基嘌呤在 所述共培养所用的培养基中的浓度为1. 5mg/L，所述1-萘乙酸在所述共培养所用的培养基 中的浓度为0. 15mg/L,所述2，4- 二氯苯氧乙酸丁酯在所述共培养所用的培养基中的浓度 为 0. 5mg/L ；所述抑菌培养所用的培养基按照如下方法制备向MS培养基中添加6-苄氨基嘌呤、 1-萘乙酸和头孢霉素，得到所述抑菌培养所用的培养基，所述6-苄氨基嘌呤在所述抑菌培 养所用的培养基中的浓度为1. 5mg/L，所述1-萘乙酸在所述抑菌培养所用的培养基中的浓 度为0. 15mg/L，所述头孢霉素在所述抑菌培养所用的培养基中的浓度为500mg/L ；所述诱导培养所用的培养基按照如下方法制备向MS培养基中添加6-苄氨基嘌呤、 1-萘乙酸、潮霉素和头孢霉素，得到所述诱导培养所用的培养基，所述6-苄氨基嘌呤在所 述诱导培养所用的培养基中的浓度为1. 5mg/L，所述1-萘乙酸在所述诱导培养所用的培养 基中的浓度为0. 15mg/L，所述潮霉素在所述诱导培养所用的培养基中的浓度为5...

【专利技术属性】
技术研发人员：马兰青，王有年，师光禄，张继星，于寒松，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]