一种提取连翘叶片ＤＮＡ的方法技术

本发明专利技术涉及提取连翘叶片ＤＮＡ的方法，有效克服连翘ＤＮＡ含有蛋白、条带弥散，Ａ２６０／２８０＝１．３８，消除连翘叶片内的酚类、鞣质等杂质的问题，方法是，连翘叶片在研钵中加液氮迅速研磨成粉末，将粉末转入离心管中，加提取缓冲液，混匀，冰浴，离心，弃去上清液，加入２×ＣＴＡＢ和β－巯基乙醇，混匀，水浴，离心，上清液置离心管中，加入氯仿和异戊醇的混合溶液，轻轻颠倒离心管，混匀，离心，重复此操作，至上清液液面无白色沉淀为止；把上清液置入离心管中，加入异丙醇，静置过夜；离心，收集沉淀，用乙醇漂洗沉淀，将离心管倒置在吸水纸上，风干，得风干物；风干物用缓冲液溶解，加入ＲＮａｓｅ，混匀，温浴，即得，本发明专利技术有效用于提取连翘叶片ＤＮＡ，纯度高，效率高。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种提取连翘叶片ＤＮＡ的方法，其特征在于：以连翘幼嫩叶片为材料，在研钵中加液氮迅速研磨成粉末，之后将粉末转入灭菌离心管中，加入０－４℃预冷的提取缓冲液Ｉ，提取缓冲液Ｉ加入量为连翘幼嫩叶片重量体积的６－１０倍，，连翘幼嫩叶片加液氮迅速研磨成的粉末与提取缓冲液Ｉ混匀，冰浴１０ｍｉｎ，４℃下离心１０ｍｉｎ，弃去上清液，得离心后的沉淀物，沉淀物中加入提取缓冲液ＩＩ，提取缓冲液ＩＩ加入量为原连翘幼嫩叶片重量体积的６倍，沉淀物与提取缓冲液ＩＩ混匀，冰浴１０ｍｉｎ，４℃下离心１０ｍｉｎ，弃去上清液，立即加入预热的２×ＣＴＡＢ和β－巯基乙醇，２×ＣＴＡＢ加入量为连翘幼嫩叶片重量体积的６－１０倍，β－巯基乙醇加入量为每０．５ｇ连翘幼嫩叶片原材料加入６０－１２０μＬ，充分混匀，在６５℃水浴中保温４ｈ期间每隔０．５ｈ轻轻摇动离心管一次；温浴后，４℃下离心１０ｍｉｎ；取上清液置灭菌离心管中，加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇混合溶液，其混合溶液的配比是氯仿和异戊醇体积比２４∶１，轻轻颠倒离心管，混匀，４℃下离心１０ｍｉｎ，重复此操作，至上清液与氯仿和异戊醇混合溶液的液面无白色沉淀为止；把上清液转移到灭菌离心管中，加入２／３倍量上清液体积、并于－２０℃预冷的异丙醇，轻轻晃动，于－２０℃静置过夜；４℃下离心５ｍｉｎ，收集沉淀，弃去上清液，用７５％（Ｖ／Ｖ）的乙醇漂洗沉淀２－３次，每次用量为连翘幼嫩叶片原材料重量体积的２倍，将离心管倒置在吸水纸上，风干，得风干物；每０．５ｇ连翘幼嫩叶片原材料制得的风干物用５０－６０μＬＴＥ缓冲液溶解，并加入０．５μＬ５－１０ｍｇ／ｍＬＲＮａｓｅ，轻轻混匀，于３７℃水浴中温浴３０ｍｉｎ，即得到高质量的可直接用于ＰＣＲ扩增的连翘叶片基因组ＤＮＡ；　　所说的提取缓冲液Ｉ是由０．２５ｍｏｌ／Ｌ－Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ－ＥＤＴＡ、０．２５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ和余量为水混合均匀制成；所说的提取缓冲液ＩＩ是由１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ，２０ｍｍｏｌ／Ｌ－ＥＤＴＡ，０．２５ｍｏｌ／Ｌ－ＮａＣｌ，０．０２５ｍｏｌ／Ｌ－Ｎａ↓［２］Ｂ↓［４］Ｏ↓［７］和余量为水混合均匀制成。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：冯卫生，陈随清，董诚明，苏秀红，李汉伟，
申请(专利权)人：河南中医学院，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]