一种穿梭质粒、以及高效表达杀菌肽与溶菌酶基因的方法技术

本发明专利技术属于生物基因工程领域，提供了一种穿梭质粒、以及高效表达杀菌肽与溶菌酶基因的方法。本发明专利技术构建了适合于在原核生物（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、球形芽孢杆菌）中表达的大肠杆菌一枯草杆菌穿梭质粒。在原核生物中表达的杀菌肽对宿主不表现毒杀作用。通过本发明专利技术的穿梭质粒表达人溶菌酶和牛乳铁蛋白等多种杀菌肽的融合蛋白获得成功。本发明专利技术构建的表达质粒中引入了６Ｈｉｓ，纯化方便，纯化后的融合蛋白经溶葡球菌酶对各融合肽段间酶切位点的识别并正确切割，释放出各功能肽使其恢复活性，又免去分离切割酶而直接使用的一种有效而简便的技术方法。本发明专利技术的穿梭质粒还具有一定的共用性，适合的基因都可进行克隆表达。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种高效表达杀菌肽与溶菌酶基因的方法，其特征在于：所述的方法包括一个酶切ｐＥ１９４和ｐＵＣ１８质粒的步骤，将酶切后的ｐＥ１９４和ｐＵＣ１８质粒采用连接酶连接，又包括一个将连接后的质粒转化的步骤，得到能在大肠杆菌和枯草杆菌中穿梭表达克隆基因的穿梭质粒转化子，还包括一个构建启动子信号肽功能片段的步骤，在所述的构建启动子信号肽功能片段的步骤中，在所述的启动子信号肽功能片段中克隆有启动子，在所述的启动子信号肽功能片段中克隆有信号肽序列，采用ＰＣＲ扩增该启动子信号肽的引物序列为：　　Ｐ１：５－ＡＧＡＡＴＴＣＧＧＡＡＣＴＣＴＴＧＡＡＴＧＴＴＴＡ，　　Ｐ２：５－ＡＣＴＴＴＴＴＴＴＣＧＣＴＡＧＣＡＴＧＴＧＴＴＴＣ，　　在所述的启动子信号肽功能片段中克隆有效的终止子，　　采用ＰＣＲ扩增终止子的引物序列为：　　Ｐ１：５－ＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡＧＣＧＣＧＣＴＴＴＴＴＡ，　　Ｐ２：５－ＴＴＧＣＴＡＧＣＧＧＴＡＣＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣ，　　Ｐ３：５－ＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＴＣＡＡＣＴＴＴＡＧＧＡＡＴＧ，　　在所述的启动子信号肽功能片段上克隆有６Ｈｉｓ，　　在所述的启动子信号肽功能片段上克隆有溶葡球菌酶的酶切识别位点；　　还包括一个将启动子信号肽功能片段插入穿梭质粒转化子的步骤，形成具有启动子信号肽功能的穿梭质粒；　　还包括一个在穿梭质粒中插入人源溶菌酶、或者杀菌肽与人源溶菌酶的融合蛋白的步骤，形成能表达杀菌肽基因、或者人源溶菌酶基因的穿梭质粒；　　还包括一个将插入了人源溶菌酶、或者杀菌肽与人源溶菌酶的融合蛋白的穿梭质粒转化的步骤；　　还包括一个发酵培养穿梭质粒的工程菌的步骤；　　还包括一个穿梭质粒的表达和纯化步骤；还包括一个采用溶葡球菌酶切割穿梭质粒、或者穿梭质粒表达的融合蛋白的步骤，得到具有活性的杀菌肽或人源溶菌酶。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张培德，黄易明，
申请(专利权)人：上海艾魁英生物科技有限公司，张培德，
类型：发明
国别省市：31