一种高产四氢嘧啶的基因重组菌株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体公开了一种利用葡萄糖发酵产生四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法和应用。其中所述工程菌由下述表达方法得到：以野生型大肠杆菌MG1655为底盘细胞，在其染色体上多拷贝异源表达来自伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)的ectABC基因簇，赋予底盘细胞合成四氢嘧啶的能力，利用强启动子色氨酸串联启动子(Ptrp2)调控来源于T7噬菌体的RNA聚合酶，同时结合双T7启动子调控ectABC基因簇高效表达，对支路基因敲除的同时增强表达合成路径关键基因，最终构建获得高产四氢嘧啶的基因重组菌株。罐上发酵48h，四氢嘧啶最高产量达78g/L。该方法具有发酵生产原料价格低廉、培养工艺简单，设备损耗小，单批发酵产量高，成本低，易于实现工业化生产。易于实现工业化生产。易于实现工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种高产四氢嘧啶的基因重组菌株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种高产四氢嘧啶的基因重组菌株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]四氢嘧啶(Ectoine)学名四氢甲基嘧啶二羧酸，别名依克多因，是一种新型水溶性两性离子氨基酸衍生物，能够维持细胞的渗透压平衡，具有很强的水分子络合能力，使得细胞游离水结构化，是一种优秀的天然保湿剂。具有如下结构：
[0003][0004]四氢嘧啶可以对高温、冷冻、射线等极端环境中细胞内蛋白质、酶、核酸等起到保护作用，对抗紫外线对皮肤的伤害、修复紫外线导致的细胞DNA的损伤。作为一种具有保湿修复功能的天然化妆品活性成分，四氢嘧啶被广泛地应用于护肤品领域，是国际各大主流护肤品和化妆品品牌产品的主效成分之一。
[0005]目前，生产四氢嘧啶的方法主要有微生物发酵法和细胞转化法。其中，微生物发酵法主要是利用高嗜盐微生物以葡萄糖为底物采用“细菌挤奶法”工艺生产，此法虽可获得较高产量的四氢嘧啶，但工艺对生产设备要求高(耐腐蚀)，产品分离纯化难度较大，生产成本高。浙江海正药业股份有限公司授权公告号为CN 103451137 B的专利报道了一种生产四氢嘧啶的盐单胞菌及其突变株，可在较低浓度下发酵实现较高浓度的四氢嘧啶产量，发酵72h生成四氢嘧啶19.9g/L。细胞转化法主要是利用重组工程菌细胞以L
‑
天冬氨酸和甘油为底物进行酶催化合成四氢嘧啶，此法虽然避免了高嗜盐微生物生产的缺点，但酶催化过程添加大量的底物和辅因子同样导致了生产成本的增加。CN 104593442 B报道利用大肠杆菌BW
‑
pBAD
‑
ectABC转化天冬氨酸钠合成四氢嘧啶的方法，菌体重复使用5次，胞外合成四氢嘧啶87.5g，合成效率11.67g/L.d。
[0006]近年来，通过工程化大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌进行发酵合成四氢嘧啶的研究越来越多，但四氢嘧啶的产量仍然偏低。面对四氢嘧啶日益增加的市场需求，开发高产四氢嘧啶工程菌株来提高单批发酵收益来降低生产成本具有非常重要的价值。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种利用葡萄糖高效生产四氢嘧啶重组菌的构建方法，并将构建获得的重组菌株应用于四氢嘧啶的发酵生产中，实现四氢嘧啶的发酵高产量、低成本且发酵生产工艺简单，为工业化生产四氢嘧啶奠定基础。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]一株高产四氢嘧啶的基因重组菌株(ECM06)，所述重组菌株是在野生型大肠杆菌MG1655染色体上多拷贝异源表达来自伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)的ectABC基因簇，重构了四氢嘧啶合成通路，赋予重组菌株合成四氢嘧啶的能力；利用强启动子色氨酸串联启动子(Ptrp2)调控来源于T7噬菌体的RNA聚合酶(T7RNAP)，同时结合双T7启动子(SEQ ID NO.108)用于调控ectABC的高效表达；所述重组菌株包括对iclR(SEQ ID NO.109)和thrA(SEQ ID NO.110)两个基因进行敲除，在敲除iclR和thrA基因的同时对应敲入由T7启动子调控来源于谷氨酸棒状杆菌的L
‑
天冬氨酸激酶(CglysC
S301Y
)基因(SEQ ID NO.111)和L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
半醛脱氢酶(CgAsd)基因(SEQ ID NO.112)；用Ptrp2启动子替换ppc基因(SEQ ID NO.113)和pfkB基因(SEQ ID NO.114)的启动子。
[0010]所述重组菌株以大肠杆菌MG1655为宿主细胞改造获得；
[0011]所述ectABC基因簇包含的ectA、ectB、和ectC的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。
[0012]所述强启动子色氨酸串联启动子(Ptrp2)的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
[0013]本专利技术另一目的在于提供利用葡萄糖高效生产四氢嘧啶重组菌的构建方法，具体如下：
[0014](1)以大肠杆菌MG1655为出发菌株，重构四氢嘧啶合成途径：
[0015]①
构建由双T7启动子调控的ectABC表达盒，即T7
‑
ectB+T7
‑
ectAC，敲入基因组lacZ基因位点表达。
[0016]②
构建由强启动子色氨酸串联启动子(Ptrp2)调控T7RNAP表达盒，即Ptrp2
‑
T7RNAP，敲入基因组lacI基因位点表达。
[0017](2)四氢嘧啶合成途径支路基因的敲除及关键基因的增强表达
[0018]①
敲除iclR基因打开乙醛酸循环实现草酰乙酸的累积，同时在iclR基因位点敲入CglysC
S301Y
表达盒，即T7
‑
CglysC
S301Y
；
[0019]②
敲除thrA基因阻断L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
半醛流向支路代谢，同时在thrA位点敲入CgAsd表达盒，即T7
‑
CgAsd；
[0020]③
替换ppc基因启动子为Ptrp2；
[0021]④
替换pfkB基因启动子为Ptrp2。
[0022](3)ectABC的增强表达
[0023]在yeep基因位点敲入ectABC表达盒的第二个拷贝。
[0024]本专利技术的目的之二，提供一种重组菌株摇瓶发酵生产四氢嘧啶的方法，具体如下：
[0025]步骤(1)重组菌株平板活化：使用无菌接种环取重组菌株于LB固体平板上划线，倒置恒温培养至长出单菌落。
[0026]步骤(2)种子菌培养：从步骤(1)活化的LB平板上挑取单菌落(形态圆润规则)接种于含LB液体培养基的试管中，恒温振荡培养。
[0027]步骤(3)摇瓶发酵：将步骤(2)培养好的种子液按4％～10％的接种量转接于发酵培养基的摇瓶中，进行恒温培养。
[0028]优选的，在步骤(1)中，倒置恒温培养温度为37℃，培养时间为15～24h。
[0029]优选的，在步骤(2)中，恒温振荡培养温度为37℃，时间为10～15h。
[0030]优选的，在步骤(3)中，恒温培养温度为37℃，时间为15～24h。
[0031]优选的，步骤(3)中获得的重组菌株进行冷冻保藏，优选的，重组菌保藏于甘油管中。优选的，保藏温度为
‑
80℃至
‑
70℃。
[0032]在一个优选的实施方案中，摇瓶发酵15～24h后四氢嘧啶的产量达1.452g/L。
[0033]在一个优选的实施方案中，摇瓶发酵培养基组成为：葡萄糖3～8g/L；甘本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株高产四氢嘧啶的基因重组菌株，其特征在于，所述高产重组菌株是以野生型大肠杆菌MG1655为宿主细胞，进一步包括：在所述宿主细胞基因组上多拷贝异源表达来自伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)的ectABC基因簇表达盒，利用强启动子色氨酸串联启动子(Ptrp2)调控来源于T7噬菌体的RNA聚合酶(T7RNAP)，同时结合双T7启动子用于调控ectABC的高效表达；所述重组菌株包括对iclR和thrA两个基因进行敲除，在敲除iclR和thrA基因的同时对应敲入由T7启动子调控来源于谷氨酸棒状杆菌的L
‑
天冬氨酸激酶(CglysC
S301Y
)基因和L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
半醛脱氢酶(CgAsd)基因；用Ptrp2启动子替换ppc基因和pfkB基因的启动子。2.如权利要求1所述的基因重组菌株，其特征在于，所述ectABC基因簇表达盒包含的ectA、ectB和ectC的核苷酸序列依次为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；所述ectABC基因簇表达盒由双T7启动子调控，即为T7
‑
ectB+T7
‑
ectAC
‑
T7 terminator；所述强启动子色氨酸串联启动子(Ptrp2)的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。3.如权利要求1或2所述的基因重组菌株的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)以大肠杆菌MG1655为出发菌株，重构四氢嘧啶合成途径：
①
构建由双T7启动子调控的ectABC表达盒，即T7
‑
ectB+T7
‑
ectAC，敲入基因组lacZ基因位点表达；
②
构建由强启动子色氨酸串联启动子(Ptrp2)调控T7RNAP表达盒，即Ptrp2
‑
T7RNAP，敲入基因组lacI基因位点表达；(2)四氢嘧啶合成途径支路基因的敲除及关键基因的增强表达：
①
敲除iclR基因打开乙醛酸循环实现草酰乙酸的累积，同时在iclR基因位点敲入CglysC
S301Y
表达盒，即T7
‑
CglysC
S301Y
；
②
敲除thrA基因阻断L
‑
天冬氨酸
‑
β
‑
半醛流向支路代谢，同时在thrA位点敲入CgAsd表达盒，即T7
‑
CgAsd；
③
替换ppc基因启动子为Ptrp2；
④
替换pfkB基因启动子为Ptrp2；(3)ectABC的增强表达：在yeep基因位点敲入ectABC表达盒的第二个拷贝。4.一种权利要求1或2所述的基因重组菌株摇瓶发酵生产四氢嘧啶的方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤(1)重组菌株平板活化：使用无菌接种环取重组菌株于LB固体平板上划线，倒置恒温培养至长出单菌落；步骤(2)种子菌培养：从步骤(1)活化的LB平板上挑取单菌落(形态圆润规则)接种于含LB液体培养基的试管中，恒温振荡培养；步骤(3)摇瓶发酵：将步骤(2)培养好的种子液按4％～10％的接种量转接于发酵培养基的摇瓶中，进行恒温培养。5.如权利要求4所述的方法，优选的，在步骤(1)中，倒置恒温培养温度为37℃，培养时间为15～24h；在步骤(2)中，恒温振荡培养温度为37℃，时间为10～15h；在步骤(3)中，恒温...

【专利技术属性】
技术研发人员：柴保中，李晚军，李伟康，李娜，张伟，廖永康，王凯航，
申请(专利权)人：安徽普利药业有限公司，
类型：发明
国别省市：