一种表达纤维素合成酶类似蛋白的重组谷氨酸棒状杆菌及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于微生物及发酵工程技术领域，具体涉及一种表达纤维素合成酶类似蛋白的重组谷氨酸棒状杆菌及其制备方法与应用。本发明专利技术所述的重组谷氨酸棒状杆菌为采用质粒游离表达或在基因组整合表达纤维素合成酶类似蛋白CslA得到的。本发明专利技术所提供的制备方法在应用中不仅提高了谷氨酸棒状杆菌生物膜的形成能力，有利于吸附固定化反复批次发酵过程，还提高了谷氨酸棒状杆菌生产赖氨酸的能力，使得谷氨酸棒状杆菌在游离发酵和吸附固定化反复批次发酵产赖氨酸的效率得到了提高，在吸附固定化反复批次发酵中产量提高了17％以上。复批次发酵中产量提高了17％以上。复批次发酵中产量提高了17％以上。

【技术实现步骤摘要】
一种表达纤维素合成酶类似蛋白的重组谷氨酸棒状杆菌及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于微生物及发酵工程
，具体涉及一种表达纤维素合成酶类似蛋白的重组谷氨酸棒状杆菌及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]纤维素合成酶能够催化合成胞内外纤维素或具有纤维素类似结构的多糖，纤维素合成酶家族蛋白还包含一些纤维素合成酶类似蛋白(CSL)序列的亚家族，如CslA。CslA被证明是编码具有1,4
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β
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聚糖合成酶活性的酶，其主要存在于柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)、水合链霉菌(Streptomyces hyderabadensis)、白色链霉菌(Streptomyces albus)、红灰链霉菌(Streptomyces rubrogriseus)和天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)等细胞中。
[0003]微生物固定化技术，是利用物理或化学手段将游离细胞定位于限定的空间区域并使其保持活性和可以反复使用的一种基础技术。传统的固定化方法如交联固定化、包埋固定化和共价结合法导致细胞在固定化过程中易失活、细胞因物理空间限制难以长期繁殖生长、介质生物相容性差、稳定差、传质困难，因而不适合长时间连续发酵。相比之下，细胞在固体介质表面通过界面吸附、细胞聚集、细胞生长所形成的生物膜体系(biofilm)能够避免以上缺陷，是一种适合工业长期连续发酵(包括反复批次发酵)的细胞固定化方法。微生物通过自行分泌胞外多糖等生物粘附物质稳定地吸附在固体载体表面，无需其他固定化试剂的使用，即可形成具有一定三维架构和群体生活特征的生物膜体系。生物膜可提高细胞在恶劣环境下的存活率，能够增强细胞在基因表达、生长代谢、生理行为等方面的协作，提高整个群落的适存及代谢能力。基于生物膜的吸附固定化发酵，密度高、活性高、抗逆性好，能够为细胞创造有益的生长微环境。
[0004]谷氨酸棒状杆菌一直受到研究人员和工业界的青睐，是一种普遍被用于生产赖氨酸、谷氨酸等氨基酸、琥珀酸等有机酸、透明质酸等多糖、蛋白质、维生素以及生物燃料的重要工业细菌。
[0005]基于生物膜的吸附固定化发酵技术已经在许多菌株中得到了利用，已有研究通过失活或过表达谷氨酸棒状杆菌自身一些内源基因强化了谷氨酸棒状杆菌生物膜体系。本专利技术拟考察异源表达纤维素合成酶类似蛋白CslA对谷氨酸棒状杆菌生物膜的影响。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种表达纤维素合成酶类似蛋白的重组谷氨酸棒状杆菌。
[0007]本专利技术还要解决的技术问题是提供上述重组谷氨酸棒状杆菌的构建方法。
[0008]本专利技术最后要解决的技术问题是提供上述重组谷氨酸棒状杆菌的应用。
[0009]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：
[0010]针对第一个技术问题，本专利技术提供了一种表达纤维素合成酶类似蛋白的重组谷氨酸棒状杆菌，该重组谷氨酸棒状杆菌异源表达了纤维素合成酶类似蛋白CslA。
[0011]其中，所述的纤维素合成酶类似蛋白CslA来源于链霉菌Streptomyces，其蛋白序列长度通常在400
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900aa之间，具有β
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1,4糖基转移酶催化活性，可催化酶学分类号[EC:2.4.1.
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]下的反应，优选催化酶学分类号[EC:2.4.1.12]下的反应，与大肠杆菌纤维素合成酶BcsA(UniProt数据库编号为P37653)的蛋白序列相似性在20％，或者30％，或者40％，或者50％，或者60％，或者70％，或者80％，或者90％以上。
[0012]其中，所述的纤维素合成酶类似蛋白CslA的结构预测表明，该蛋白含有与pfam03552(纤维素合成酶)和PF00535(糖基转移酶家族2)相匹配的结构域。大肠杆菌的BcsA蛋白是细菌中传统纤维素合成主要相关蛋白，在细菌纤维素合成中起着关键作用，而纤维素的形成有助于生物膜和粘附基质的形成，增强细菌的适应能力和存活能力。本专利技术所述的CslA属于类似蛋白，且具有纤维素合成方面的功能，这意味着它可能与大肠杆菌的BcsA蛋白具有相似的功能。通过将不同来源的CslA纤维素合成酶类似蛋白与大肠杆菌纤维素合成酶BcsA的蛋白序列进行比较，可以帮助我们推测其功能、预测其结构，以及了解其在细菌纤维素合成中的进化关系。
[0013]优选的，所述的纤维素合成酶类似蛋白CslA可以来源于表1所列链霉菌属中的任意一种，只要与大肠杆菌纤维素合成酶BcsA的蛋白序列相似性≥20％，且具有β
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1,4糖基转移酶活性即可。
[0014]在本专利技术的一些实施例中，所述的纤维素合成酶类似蛋白CslA来源于天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor，其氨基酸序列长度如SEQ ID NO.1所示。
[0015]表1纤维素合成酶类似蛋白CslA来源情况
[0016][0017][0018]针对第二个技术问题，本专利技术提供了一种表达纤维素合成酶类似蛋白的重组谷氨酸棒状杆菌的构建方法，通过将纤维素合成酶类似蛋白CslA的基因连接到游离表达质粒或者整合表达质粒，再转化入宿主谷氨酸棒状杆菌中得到的。
[0019]其中，所述的游离表达质粒包括但不限于pEC
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XK99E、pXMJ19等，现有技术中只要能够满足纤维素合成酶类似蛋白在谷氨酸棒状杆菌中进行游离表达的质粒均适用于本专利技术。
[0020]在本专利技术的一些实施例中，所述的游离表达质粒为pXMJ19。
[0021]其中，所述的整合表达质粒包括但不限于pK18(19)
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mobsacB、pJYS3_crtYf等，现有技术中只要能够满足将纤维素合成酶类似蛋白整合在谷氨酸棒状杆菌细胞基因组上进行表达的质粒均适用于本专利技术。
[0022]在本专利技术的一些实施例中，所述的整合表达质粒为pJYS3_crtYf。
[0023]具体的，在本专利技术的一些实施例中，表达纤维素合成酶类似蛋白的重组谷氨酸棒状杆菌的构建方法为(一)或(二)中的任意一种。
[0024]在菌株构建前，首先从NCBI上查到任一所需纤维素合成酶类似蛋白CslA的蛋白质序列，例如在本专利技术的一些实施例中，纤维素合成酶类似蛋白CslA来源于天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)，序列如SEQ ID NO:1所示。根据谷氨酸棒状杆菌的密码子使用偏好性，对CslA序列进行密码子优化后，人工合成CslA序列于pUC57质粒中，得到重组质粒pUC57
‑
CslA，备用。
[0025]表达纤维素合成酶类似蛋白的重组谷氨酸棒状杆菌的构建方法(一)：
[0026]以pUC57
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CslA质粒为模板，扩增CslA基因，将得到的CslA基因片段连接到经EcoRI/HindIII酶切过的pXMJ19质粒上，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达纤维素合成酶类似蛋白的重组谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，所述的重组谷氨酸棒状杆菌异源表达了纤维素合成酶类似蛋白CslA。2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，所述的纤维素合成酶类似蛋白CslA来源于链霉菌Streptomyces，其蛋白序列长度为400
‑
900aa，具有β
‑
1,4糖基转移酶催化活性，与大肠杆菌纤维素合成酶BcsA的蛋白序列相似性在≥20％。3.权利要求1或2任意一项所述的重组谷氨酸棒状杆菌的制备方法，其特征在于，通过将纤维素合成酶类似蛋白CslA基因连接到游离表达质粒或者整合表达质粒，再转化入谷氨酸棒状杆菌中得到的。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的谷氨酸棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌Cg
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0206。5.权利要求1或2任意一项所述的重组谷氨酸棒状杆菌在微生物发酵中的应用，其中，所述的微生物发酵包括氨基酸发酵，有机酸发酵，多糖发酵，蛋白质、维生素、生物燃料好氧或厌氧发酵。6.权利要求1或2任意一项所述的重组谷氨酸棒状杆菌在发酵制备赖氨酸中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的发酵包括游离发酵和/或吸附固定化反复批次发酵。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的游离发酵和/或吸附固定化反复批次发酵，其发酵培养基成分包括碳源、氮源、无机盐、缓冲剂和辅助因子，其中，所述的碳源包括葡萄糖和糖蜜中的任意一种或两种的组合，优选80
‑
120g/L葡萄糖，更优选100g/L葡萄糖；所述的氮源包括酵母提取物、硫酸铵、尿素、玉米浆、蛋白胨和豆粕粉中的任意一种或几种的组合，优选5
‑
15g/L酵母提取物、5
‑
15g/L尿素和10
‑
20g/L硫酸铵的组合，更优选10g/L酵母提取物、10g/L尿素和15g/L硫酸铵的组合；所述的无机盐包括P
5+
、K
+
、Cu
2+
、Mn

【专利技术属性】
技术研发人员：柳东，彭西伟，应汉杰，鲍雅楠，高雅情，邹金顺，牛欢青，陈勇，庄伟，朱晨杰，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：