一种合成肌醇的重组谷氨酸棒杆菌和应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程和微生物技术应用领域，具体涉及一种合成肌醇的重组谷氨酸棒杆菌和应用。包括宿主菌谷氨酸棒杆菌ATCC 13032和转入所述宿主菌的质粒载体，所述质粒载体中同时导入了编码合成磷酸

【技术实现步骤摘要】
一种合成肌醇的重组谷氨酸棒杆菌和应用


[0001]本专利技术属于生物工程和微生物技术应用领域，具体涉及一种合成肌醇的重组谷氨酸棒杆菌和应用。

技术介绍

[0002]肌醇(myo
‑
inositol)，又名环己六醇，广泛分布于动植物体内，是动物和微生物的生长因子。肌醇普遍存在于生物系统中，它是肌醇磷酸盐和脂质的前体，参与各种生物功能，如生长调节、膜形成、信号传导和渗透压耐受。此外，它还显示出类似于胰岛素的功能，有助于降低餐后血糖，因此可应用于膳食补充剂等方面，其结构式如下：
[0003][0004]肌醇是一种水溶性维生素，是一种糖醇类化合物，为白色晶体，无臭，能稳定存在于空气中。肌醇能促进脂质代谢、模拟胰岛素功能降低血糖并且是人类和其他动物所必需的微量元素，在医药、食品、饲料工业领域中具有重要作用。目前肌醇的主要合成方法是植酸水解法和体外酶催化法。植酸水解法是传统的肌醇生产方法，但因其需要使用各种酸碱试剂且反应条件苛刻，存在成本高、产率低、造成环境污染的问题；体外酶催化法虽然对环境相对友好，但是也存在酶不稳定、分离过程复杂等问题。因此亟需一种有效的生物合成途径用于高效生产肌醇。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种合成肌醇的重组谷氨酸棒杆菌和应用，通过表达磷酸
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肌醇合酶Ino1和磷酸
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肌醇单磷酸酶SuhB，实现采用生物方法高效合成肌醇，为肌醇工业化生产提供了重要的依据。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0007]本专利技术提供了一种合成肌醇的重组谷氨酸棒状菌，包括宿主菌谷氨酸棒杆菌ATCC 13032和转入所述宿主菌的质粒载体，所述质粒载体中同时导入了编码合成磷酸
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肌醇的酶Ino1和肌醇
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单磷酸酶SuhB的基因，所述Ino1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SuhB的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]进一步的，所述重组谷氨酸棒状菌还包括敲除编码四种肌醇脱氢酶IolG、OxiB、OxiD、OxiE的基因的质粒载体。
[0009]进一步的，所述质粒载体将葡萄糖
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磷酸异构酶Pgi的启动子更换为谷氨酸棒杆菌中内源弱启动子P
dapA
。
[0010]进一步的，所述重组谷氨酸棒状菌还包括敲除编码葡萄糖
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磷酸脱氢酶Zwf的基因的质粒载体。
[0011]本专利技术还提供了一种利用所述重组谷氨酸棒状菌在合成肌醇中的应用。
[0012]进一步的，所述应用为将所述重组谷氨酸棒状菌接种到培养基中，向所述培养基中加入诱导剂，在30℃进行发酵处理，制得肌醇。
[0013]进一步的，所述培养基包括：42g/LMOPS、40g/L葡萄糖、1.0g/L K2HPO4、1.0g/LKH2PO4和20g/L(NH4)SO4、FeSO4·
7H2O 10mg/L、MnSO4·
H2O 10mg/L、ZnSO4·
7H2O1mg/L、CuSO4·
5H2O 0.2mg/L、NiCl2·
6H2O 0.02mg/L、生物素0.2mg/L、原儿茶酸30mg/L。
[0014]进一步的，所述接种的接种量为1
‑
10％。
[0015]进一步的，所述发酵处理的时间为12
‑
36h。
[0016]本专利技术的一个主要目的是在谷氨酸棒杆菌中通过改造宿主菌从而高产肌醇。利用该生物合成肌醇的重组谷氨酸棒杆菌合成肌醇，打通在谷氨酸棒杆菌中肌醇生物合成的途径。
[0017]本专利技术的第二个目的是提供一种利用简单碳源如葡萄糖等来合成肌醇的重组谷氨酸棒杆菌。
[0018]本专利技术的第三个目的在于通过阻断降解途径、抑制竞争途径、解除生产和生长的竞争等一系列代谢调控方式来提高肌醇的产量，实验结果表明，在正常条件下，代谢工程改造菌利用葡萄糖等简单碳源来生产肌醇，能达到14.67g/L的产量。
[0019]本专利技术还在所述宿主菌中将编码葡萄糖
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磷酸异构酶Pgi的基因启动子更换为一种谷氨酸棒杆菌内源弱启动子P
dapA
，从而提高葡萄糖
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磷酸的利用率，进而降低生产和生长之间的竞争。所述宿主菌通过采用pK18mobsacB双同源重组方法敲除了其中消耗葡萄糖
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磷酸的基因，以减少因宿主菌造成的葡萄糖
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磷酸的消耗，实现通过抑制竞争途径的方式提高上述合成肌醇的工程菌生产肌醇的产量。
[0020]请参阅图1，利用本专利技术提供的上述合成肌醇的工程菌主要在含有葡萄糖的培养基中发酵培养，以合成肌醇的主要原因是：葡萄糖在所述工程菌携带的质粒表达磷酸
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肌醇合酶Ino1和磷酸
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肌醇单磷酸酶SuhB催化葡萄糖生产肌醇。
[0021]具体地，从图1中可以看出：上述葡萄糖可以经过PtsG系统和非磷酸化葡萄糖转运系统Glk、Ppgk转运进入重组谷氨酸棒杆菌，从而生成葡萄糖
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磷酸；部分葡萄糖
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磷酸在葡萄糖
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磷酸异构酶Pgi的催化下进入糖酵解，部分葡萄糖被磷酸
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肌醇合酶Ino1和磷酸
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肌醇单磷酸酶SuhB催化生成肌醇。负责将葡萄糖
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磷酸引入磷酸戊糖途径的关键酶Zwf被敲除；负责将肌醇引入肌醇降解途径的四种肌醇脱氢酶被敲除。
[0022]由此可见，本专利技术提供的合成肌醇的重组谷氨酸棒杆菌在发酵培养的过程中，可以在磷酸
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肌醇合酶Ino1和磷酸
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肌醇单磷酸酶SuhB的作用下实现生物合成肌醇。
[0023]本专利技术提供的合成肌醇的重组谷氨酸棒杆菌通过降低生产和生长之间的竞争，敲除竞争和降解途径等方法对所述重组谷氨酸棒杆菌进行优化，以提高利用合成肌醇的重组谷氨酸棒杆菌合成肌醇的能力。
[0024]本专利技术公开了以下技术效果：
[0025]本专利技术通过表达磷酸
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肌醇合酶Ino1和磷酸
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肌醇单磷酸酶SuhB，构建了上述说明的合成肌醇的重组谷氨酸棒杆菌；以该合成肌醇的重组谷氨酸棒杆菌为基础，设计出如图1所示的肌醇的生物合成途径，并且利用分子生物学以及代谢调控来优化合成路径，从而实现采用生物方法高效合成肌醇。利用本专利技术提供的合成肌醇的重组谷氨酸棒杆菌生产肌醇具有方法简单、成本低廉、工业安全等优点，有利于工业化放大生产，降低生产成本，可
直接应用于食品、医疗等行业，为肌醇工业化生产提供了重要的依据。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种合成肌醇的重组谷氨酸棒状菌，其特征在于，包括宿主菌谷氨酸棒杆菌ATCC 13032和转入所述宿主菌的质粒载体，所述质粒载体中同时导入了编码合成磷酸
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肌醇的酶Ino1和肌醇
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单磷酸酶SuhB的基因，所述Ino1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SuhB的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的合成肌醇的重组谷氨酸棒状菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒状菌还包括敲除编码四种肌醇脱氢酶IolG、OxiB、OxiD、OxiE的基因的质粒载体。3.根据权利要求1所述的合成肌醇的重组谷氨酸棒状菌，其特征在于，所述质粒载体将葡萄糖
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磷酸异构酶Pgi的启动子更换为谷氨酸棒杆菌中内源弱启动子P
dapA
。4.根据权利要求2所述的合成肌醇的重组谷氨酸棒状菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒状菌还包括敲除编码葡萄糖
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磷酸脱氢酶Zwf的基因的质粒载体。5.一种利用如权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：袁其朋，孙新晓，戴玖，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：