一种用于治疗高苯丙氨酸血症的工程微生物及其用途制造技术

本公开提供了一种工程微生物，其包含编码芳香族氨基酸转氨酶的基因、编码苯丙氨酸脱氢酶的基因、编码苯丙酮酸脱羧酶的基因、编码醛还原酶的基因、编码谷氨酸脱氢酶的基因和编码苯丙氨酸转运蛋白的基因中的一种或多种或其功能等效物。本公开还涉及包含所述基因中的一种或多种或其功能等效物的工程微生物组合物；包含所述工程微生物或工程微生物组合物的组合物；使用所述工程微生物或工程微生物组合物或组合物来缓解和/或治疗与高苯丙氨酸血症相关的疾病和/或病症的方法；以及所述工程微生物或工程微生物组合物或组合物在制备用于治疗与高苯丙氨酸血症相关的疾病和/或病症的药物或保健品中的用途。物或保健品中的用途。物或保健品中的用途。

【技术实现步骤摘要】
一种用于治疗高苯丙氨酸血症的工程微生物及其用途


[0001]本公开涉及基因工程领域，具体涉及一种工程微生物以及工程微生物组合物，包含该工程微生物或工程微生物组合物的组合物，使用所述工程微生物或工程微生物组合物或来缓解和/或治疗与高苯丙氨酸血症相关的疾病和/或病症的方法，所述工程微生物或工程微生物组合物在制备用于缓解或治疗与高苯丙氨酸血症相关的疾病和/或病症的药物或保健品中的用途。

技术介绍

[0002]高苯丙氨酸血症(hyperphenylalaninemia，HPA)是指由于苯丙氨酸代谢途径中的酶发生缺陷，例如苯丙氨酸羟化酶(PAH)、四氢生物喋呤合成酶或二氢生物喋呤还原酶等产生突变，导致血液中苯丙氨酸(Phe)水平过高的一类先天性苯丙氨酸代谢障碍疾病。其中苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)是由于苯丙氨酸代谢途径中苯丙氨酸羟化酶(PAH)发生突变导致，使得苯丙氨酸不能转变成为酪氨酸，致使苯丙氨酸与α
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酮戊二酸在血液与组织中堆积，并从尿中大量排出。健康人血液中苯丙氨酸的含量在100μM左右。通常认为人血液中的苯丙氨酸的含量在360μM～600μM以上，便会有苯丙酮尿症症状。在中国，苯丙酮尿症在新生儿中的发病率大概在1/11000，苯丙酮尿症患儿出生若不及时诊治，将会严重影响患儿的智力发育，引起癫痫和运动障碍等症状，并伴随黑色素合成障碍。
[0003]目前对于这种疾病的治疗主要是对食物的控制。苯丙酮尿症患者通过干预饮食或治疗，可以使血清苯丙氨酸水平保持在120
‑<br/>360μM范围内，可能有助于缓解与疾病相关的认知障碍。但这种治疗方式往往影响新生儿或青少年的成长，以及孕妇腹中胎儿的发育；饮食治疗需要长期、不间断的治疗，给病人和家庭造成极大的经济负担。除了控制饮食外，近些年出现的经批准的苯丙酮尿症治疗药物有盐酸沙丙蝶呤和苯丙氨酸解氨酶。然而，盐酸沙丙蝶呤不能作为一种单独的治疗方法，需要与控制饮食结合使用；苯丙氨酸解氨酶是最近被批准用于治疗成人苯丙酮尿症患者，依靠全身注射苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)，然而，该疗法常伴随严重的过敏反应和免疫介导的不良反应。科学家也在尝试基因疗法，将携带表达苯丙氨酸羟化酶基因(PAH)的cDNA重组腺病毒置于小鼠体内，以恢复肝脏PAH活性，但目前主要存在转运效率低的问题，且基因治疗的研发成本高，治疗费用昂贵，对于大多数病人来说接受程度低。
[0004]当前临床治疗方法比如饮食控制、酶辅助因子、酶制剂都没有达到很好的临床效果，亟需新的治疗方法。在新药研发的尝试中，AAV基因治疗由于显示出潜在的肝脏致癌毒性而部分公司暂停了临床试验，红细胞递送酶基因的方法显示出较低的表达水平而部分公司暂停了临床前研究。因此，本领域迫切需要开发得到一种新型有效的能够治疗或缓解苯丙氨酸代谢障碍相关疾病和/或病症的药物或保健品。

技术实现思路

[0005]为了寻求更新更有效的能够治疗或缓解苯丙氨酸代谢障碍相关疾病和/或病症的
药物或保健品，本公开尝试使用工程微生物作为递送苯丙氨酸相关降解酶的载体，利用基因工程技术来改造出发微生物(例如肠道益生菌)，构建能够降解苯丙氨酸使之生成无毒害的中间代谢物、能够有效降低动物(包括人)体内苯丙氨酸水平的工程微生物。
[0006]根据本公开的一种实施方式，可以提供一种导入外源基因的工程微生物，其特征在于，所述外源基因包括：一种或更多种编码能够将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸的酶的基因；一种或更多种编码能够将苯丙酮酸转化为苯乙醛的酶的基因；一种或更多种编码能够将苯乙醛转化为苯乙醇的酶的基因；以及一种或更多种编码能够将苯丙氨酸转运至所述工程微生物体内的蛋白的基因。。
[0007]根据本公开的一种实施方式，可以提供一种工程微生物组合物，其包含多于一种工程微生物，所述多于一种工程微生物中的每一种彼此独立地包含以下基因中的任一种或更多种：
[0008]编码能够将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸的酶的基因；
[0009]编码能够将苯丙酮酸转化为苯乙醛的酶的基因；
[0010]编码能够将苯乙醛转化为苯乙醇的酶的基因；
[0011]其中所述工程微生物组合物包含编码能够将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸的酶的基因、编码能够将苯丙酮酸转化为苯乙醛的酶的基因以及编码能够将苯乙醛转化为苯乙醇的酶的基因。
[0012]根据本公开的一种实施方式，可以提供一种组合物，其包含根据本公开所述的工程微生物或工程微生物组合物和药学上、营养学上或生理学上可接受的载体。
[0013]根据本公开的一种实施方式，可以提供一种试剂盒，其包含根据本公开所述的工程微生物或根据本公开所述的工程微生物组合物或根据本公开所述的组合物。
[0014]根据本公开的一种实施方式，可以提供一种用于缓解和/或治疗与高苯丙氨酸血症相关的疾病和/或病症的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用根据本公开所述的工程微生物或根据本公开所述的工程微生物组合物或根据本公开所述的组合物或根据本公开所述的试剂盒。
[0015]根据本公开的一种实施方式，可以提供本公开所述的工程微生物或根据本公开所述的工程微生物组合物或根据本公开所述的组合物在制备用于缓解和/或治疗与高苯丙氨酸血症相关的疾病和/或病症的药物或保健品中的用途。
附图说明
[0016]图1描绘了质粒PCBT003的图谱。
[0017]图2描绘了质粒PCBT001的图谱。
[0018]图3描绘了有氧条件下工程菌株EcN、CBT2001、CBT2002和CBT2003降解苯丙氨酸的体外检测结果。
[0019]图4描绘了厌氧条件下工程菌株EcN、CBT2001、CBT2002和CBT2003降解苯丙氨酸的体外检测结果。
[0020]图5描绘了工程菌株CBT209和CBT210降解苯丙氨酸的体外检测结果。
[0021]图6描绘了工程菌株CBT201降解苯丙氨酸的体外检测结果。
[0022]图7描绘了工程菌株CBT202降解苯丙氨酸的体外检测结果。
[0023]图8描绘了工程菌株CBT205和CBT206降解苯丙氨酸的体外检测结果。
[0024]图9描绘了工程菌株CBT207和CBT208降解苯丙氨酸的体外检测结果。
[0025]图10描绘了工程菌株CBT201、CBT205、CBT207和CBT211降解苯丙氨酸的体外检测结果。
[0026]图11描绘了工程菌株CBT
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201、CBT
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212、CBT
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213、CBT
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205和CBT
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207体外降解苯丙氨酸的检测结果。
[0027]图12描绘了工程菌株CBT
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201、CBT
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201
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AA、CBT
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205、阴性对照组EcN和活性参照组SYNB1934体内降解苯丙氨酸的结果。
具体实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种工程微生物，其包含下列外源基因：一种或更多种编码能够将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸的酶的基因；一种或更多种编码能够将苯丙酮酸转化为苯乙醛的酶的基因；一种或更多种编码能够将苯乙醛转化为苯乙醇的酶的基因；以及一种或更多种编码能够将苯丙氨酸转运至所述工程微生物体内的蛋白的基因。2.根据权利要求1所述的工程微生物，所述工程微生物能够在人和/或哺乳动物肠道内代谢苯丙氨酸。3.根据权利要求1至2中任一项所述的工程微生物，其中，所述编码能够将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸的酶的基因选自编码苯丙氨酸脱氢酶的基因、编码芳香族氨基酸转氨酶的基因、编码L
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氨基酸脱氨酶的基因、及其功能等效物中的一种或多种，所述功能等效物至少保留相关酶的部分活性；所述编码能够将苯丙酮酸转化为苯乙醛的酶的基因选自编码苯丙酮酸脱羧酶的基因、编码α
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酮酸脱羧酶的基因、及其功能等效物中的一种或多种，所述功能等效物至少保留相关酶的部分活性；所述编码能够将苯乙醛转化为苯乙醇的酶的基因选自编码醛还原酶的基因及其功能等效物中的一种或多种，所述功能等效物至少保留相关酶的部分活性；和/或所述编码能够将苯丙氨酸转运至所述工程微生物体内的蛋白的基因选自编码苯丙氨酸转运蛋白的基因及其功能等效物中的一种或更多种，所述功能等效物至少保留相关酶的部分活性。4.根据权利要求3所述的工程微生物，其中所述编码能够将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸的酶的基因选自以下组：(1)编码苯丙氨酸脱氢酶的基因；(2)编码芳香族氨基酸转氨酶的基因；(3)编码芳香族氨基酸转氨酶的基因和编码苯丙氨酸脱氢酶的基因；(4)编码苯丙氨酸脱氢酶的基因和编码L
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氨基酸脱氨酶的基因；(5)编码芳香族氨基酸转氨酶的基因和编码L
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氨基酸脱氨酶的基因；或(6)编码芳香族氨基酸转氨酶的基因、编码苯丙氨酸脱氢酶的基因、和编码L
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氨基酸脱氨酶的基因。5.根据权利要求4所述的工程微生物，其中，第(2)、(3)、(5)、或(6)项中，所述工程微生物还包含编码谷氨酸脱氢酶的基因及其功能等效物中的一种或多种，所述功能等效物至少保留相关酶的部分活性。6.根据权利要求3至5中任一项所述的工程微生物，其中，所述编码苯丙氨酸脱氢酶的基因是芽孢杆菌SLBN
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3(Bacillussp.SLBN
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3)的PheDH(Phenylalanine Dehydrogenase)，优选地，所述苯丙氨酸脱氢酶具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，或者编码所述苯丙氨酸脱氢酶的基因具有如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列；所述编码芳香族氨基酸转氨酶的基因选自大肠杆菌BL21(DE3)(Escherichia coliBL21(DE3))的TyrB(Tyrosine aminotransferase)或酿酒酵母S288C(Saccharomyces cerevisiae S288C)的ARO8(Bifunctional 2
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aminoadipate transaminase/aromatic
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amino
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acid:2
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oxoglutarate transaminase)，优选地，所述芳香族氨基酸转氨酶具有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或者编码所述芳香族氨基酸转氨酶的基因具有如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:90所示的核苷酸序列；所述编码L
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氨基酸脱氨酶的基因选自大肠杆菌BL21(DE3)、酿酒酵母S288C、或奇异变形杆菌HI4320(Proteus mirabilis HI4320)的LAAD(L
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amino acid deaminase)，优选地，所述L
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氨基酸脱氨酶具有如SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列，或者编码所述L
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氨基酸脱氨酶的基因具有如SEQ ID NO:91所示的核苷酸序列；所述编码苯丙酮酸脱羧酶的基因是酿酒酵母S288C的ARO10(Phenylpyruvate decarboxylase)，优选地，所述苯丙酮酸脱羧酶具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，或者编码所述苯丙酮酸脱羧酶的基因具有如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列；所述编码α
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酮酸脱羧酶的基因选自酿酒酵母S288C的或奇异变形杆菌JN458(Proteus mirabilis JN458)的KDC(Alpha
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keto
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acid decarboxylase)，优选地，所述α
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酮酸脱羧酶具有如SEQ ID NO:8所示的序列，或者编码所述α
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酮酸脱羧酶的基因具有如SEQ ID NO:95所示的核苷酸序列；所述编码醛还原酶的基因选自大肠杆菌str.K
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12substr.MG1655的YahK(NADPH
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dependent aldehyde reductase)或短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的ADH(Alcohol dehydrogenase)，优选地，所述醛还原酶具有如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，或者编码所述醛还原酶的基因具有如SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:96所示的核苷酸序列；所述编码苯丙氨酸转运蛋白的基因是大肠杆菌的PheP(Phenylalanine:H(+)symporter)，优选地，所述苯丙氨酸转运蛋白具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，或者编码所述苯丙氨酸转运蛋白的基因具有如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列；和/或所述编码谷氨酸脱氢酶的基因选自酿酒酵母S288C的或艰难梭菌(Clostridioides difficile)的GDH2(Glutamate dehydrogenase(NAD+))，优选地，所述谷氨酸脱氢酶具有如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，或者编码所述谷氨酸脱氢酶的基因具有如SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:97所示的核苷酸序列。7.根据权利要求3至6中任一项所述的工程微生物，其中所述编码能够将苯丙氨酸转化为苯丙酮酸的酶的基因、所述编码能够将苯丙酮酸转化为苯乙醛的酶的基因、所述编码能够将苯乙醛转化为苯乙醇的酶的基因、所述编码能够将苯丙氨酸转运至所述工程微生物体内的蛋白的基因、和/或所述编码谷氨酸脱氢酶的基因位于一个或多个表达盒中；优选地，所述表达盒存在于质粒上或者稳定整合在所述工程微生物的一个、两个、或多个相同或者不同的基因组位点中。8.根据权利要求7所述的工程微生物，其中所述工程微生物包含第一表达盒、第二表达盒和可选的第三表达盒，其中第一表达盒包含第一启动子、以及与其可操作连接的所述编码芳香族氨基酸转氨酶的基因和所述编码谷氨酸脱氢酶的基因；第二表达盒包含第二启动子、以及与其可操作连接的所述编码苯丙酮酸脱羧酶的基因和编码醛还原酶的基因；第三表达盒包含可操作地连接至第三启动子的所述编码苯丙氨酸转运蛋白的基因；其中所述第一、第二或第三启动子是相同的或者不同的；或者所述工程微生物包含第四表达盒、第二表达盒、可选的第一表达盒和可选的第五表达
盒，其中第四表达盒包含第四启动子、以及与其可操作连接的所述编码苯丙氨酸脱氢酶的基因和编码苯丙氨酸转运蛋白的基因；第二表达盒包含第二启动子、以及与其可操作连接的所述编码苯丙酮酸脱羧酶的基因和编码醛还原酶的基因；第一表达盒包含第一启动子、以及与其可操作连接的所述编码芳香族氨基酸转氨酶的基因和所述编码谷氨酸脱氢酶的基因；第五表达盒包含第五启动子、与其可操作连接的所述编码L

【专利技术属性】
技术研发人员：向斌，孙婉菊，刘翠翠，朱丽，
申请(专利权)人：和度生物技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：